Optimisation du modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne pour limiter la variabilité

Summary

Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’occlusion veineuse rétinienne à l’aide de rose bengale et un système de microscope d’imagerie rétinienne guidé par laser avec des recommandations pour maximiser sa reproductibilité dans les souches génétiquement modifiées.

Abstract

Les modèles murins d’occlusion veineuse rétinienne (OVR) sont souvent utilisés en ophtalmologie pour étudier les lésions hypoxiques-ischémiques dans la rétine neurale. Dans ce rapport, une méthode détaillée soulignant les étapes critiques est fournie avec des recommandations d’optimisation pour atteindre des taux d’occlusion constamment réussis sur différentes souches de souris génétiquement modifiées. Le modèle murin RVO consiste principalement en l’administration intraveineuse d’un colorant photosensibilisateur suivie d’une photocoagulation au laser à l’aide d’un microscope imageur rétinien fixé à un laser guidé ophtalmique. Trois variables ont été identifiées comme déterminants de la cohérence de l’occlusion. En ajustant le temps d’attente après l’administration de rose bengal et en équilibrant la sortie laser de base et expérimentale, la variabilité entre les expériences peut être limitée et un taux de réussite plus élevé des occlusions obtenu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les maladies rétiniennes caractérisées par un œdème rétinien et une lésion hypoxique-ischémique. De plus, comme ce modèle induit des lésions vasculaires, il peut également être appliqué pour étudier la neurovascularisation, la mort neuronale et l’inflammation.

Introduction

L’occlusion veineuse rétinienne (OVR) est une maladie vasculaire rétinienne courante qui a touché environ 28 millions de personnes dans le monde en 2015¹. L’OCV entraîne un déclin et une perte de vision chez les adultes et les personnes âgées en âge de travailler, ce qui représente une maladie menaçant la vue qui devrait augmenter au cours de la décennie proche. Certaines des pathologies distinctes de la RVO comprennent les lésions hypoxiques-ischémiques, l’œdème rétinien, l’inflammation et la perte neuronale². Actuellement, la première ligne de traitement pour ce trouble est par l’administration d’inhibiteurs du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Bien que le traitement anti-VEGF ait contribué à améliorer l’œdème rétinien, de nombreux patients sont encore confrontés à un déclin de la vision³. Pour mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie et tester de nouvelles lignes de traitement potentielles, il est nécessaire de constituer un protocole modèle de souris RVO fonctionnel et détaillé pour différentes souches de souris.

Des modèles de souris ont été développés en mettant en œuvre le même dispositif laser utilisé chez les patients humains, associé à un système d’imagerie adapté à la taille correcte pour une souris. Ce modèle murin de RVO a été signalé pour la première fois en 2007 4 et établi par Ebneter et al. ^4,5. Finalement, le modèle a été optimisé par Fuma et al. pour reproduire les principales manifestations cliniques de la RVO telles que l’œdème^{rétinien 6}. Depuis que le modèle a été rapporté pour la première fois, de nombreuses études l’ont utilisé en utilisant l’administration d’un colorant photosensibilisant suivie d’une photocoagulation des principales veines rétiniennes avec un laser. Cependant, la quantité et le type de colorant administré, la puissance laser et le temps d’exposition varient considérablement d’une étude à l’autre qui ont utilisé cette méthode. Ces différences peuvent souvent entraîner une variabilité accrue du modèle, ce qui le rend difficile à reproduire. À ce jour, il n’existe aucune étude publiée avec des détails spécifiques sur les pistes potentielles d’optimisation.

Ce rapport présente une méthodologie détaillée du modèle murin RVO dans la souche C57BL/6J et une souche de caspase-9 endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J et pertinente pour la pathologie RVO comme souche de référence pour une souris génétiquement modifiée. Une étude antérieure avait montré que l’activation non apoptotique de la caspase-9 endothéliale provoque un œdème rétinien et favorise la mort neuronale⁸. L’expérience d’utilisation de cette souche a permis de déterminer et de donner un aperçu des modifications potentielles pour adapter le modèle murin RVO, qui peut être applicable à d’autres souches génétiquement modifiées.

Protocol

Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia. NOTE: Toutes les expériences ont utilisé des souris mâles âgées de deux mois qui pesaient environ 20 g. 1. Préparation et …

Representative Results

Le modèle murin RVO vise à obtenir avec succès des occlusions dans les veines rétiniennes, entraînant une lésion hypoxique-ischémique, une rupture de la barrière rétinienne sanguine, une mort neuronale et un œdèmerétinien 8. La figure 1 montre une chronologie des étapes pour assurer la reproductibilité, un schéma de la conception expérimentale et décrit les étapes qui peuvent être optimisées davantage en fonction des questions expérimentales. Les …

Discussion

Le modèle de RVO chez la souris offre un moyen de mieux comprendre la pathologie de la RVO et de tester des traitements potentiels. Bien que le modèle RVO de souris soit largement utilisé sur le terrain, il est nécessaire de disposer d’un protocole détaillé actuel du modèle qui traite de sa variabilité et décrit l’optimisation du modèle. Ici, nous fournissons un guide avec des exemples d’expérience sur ce qui peut être modifié pour obtenir les résultats les plus cohérents dans une cohorte d’animaux…

Materials

Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20