Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Abstract

Modelos de camundongos de oclusão da veia retiniana (RVO) são frequentemente usados em oftalmologia para estudar a lesão hipóxico-isquêmica na retina neural. Neste relatório, um método detalhado que aponta etapas críticas é fornecido com recomendações para otimização para alcançar taxas de oclusão consistentemente bem-sucedidas em diferentes cepas de camundongos geneticamente modificados. O modelo de camundongo RVO consiste principalmente na administração intravenosa de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação a laser usando um microscópio de imagem da retina ligado a um laser guiado oftálmico. Três variáveis foram identificadas como determinantes da consistência da oclusão. Ajustando o tempo de espera após a administração de rosa bengala e equilibrando a linha de base e a saída experimental do laser, a variabilidade entre os experimentos pode ser limitada e uma maior taxa de sucesso das oclusões alcançada. Este método pode ser usado para estudar doenças da retina que são caracterizadas por edema de retina e lesão hipóxico-isquêmica. Além disso, como esse modelo induz lesão vascular, ele também pode ser aplicado para estudar a neurovasculatura, a morte neuronal e a inflamação.

Introduction

A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença vascular comum da retina que afetou aproximadamente 28 milhões de pessoas em todo o mundo em 2015¹. RVO leva ao declínio da visão e perda em adultos em idade ativa e idosos, representando uma doença que ameaça a visão em curso estima-se que aumente ao longo da década próxima. Algumas das patologias distintas do RVO incluem lesão hipóxico-isquêmica, edema de retina, inflamação e perda neuronal². Atualmente, a primeira linha de tratamento para este distúrbio é através da administração de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Embora o tratamento anti-VEGF tenha ajudado a melhorar o edema da retina, muitos pacientes ainda enfrentam declínio da visão³. Para entender melhor a fisiopatologia desta doença e testar possíveis novas linhas de tratamento, há a necessidade de constituir um protocolo de modelo de camundongo RVO funcional e detalhado para diferentes cepas de camundongos.

Modelos de camundongos foram desenvolvidos implementando o mesmo dispositivo a laser usado em pacientes humanos, emparelhado com um sistema de imagem dimensionado para o tamanho correto para um mouse. Este modelo de RVO em camundongo foi relatado pela primeira vez em 2007 4 e posteriormente estabelecido por Ebneter e outros ^4,5. Eventualmente, o modelo foi otimizado por Fuma et al. para replicar as principais manifestações clínicas do RVO, como o edema de retina⁶. Desde que o modelo foi relatado pela primeira vez, muitos estudos o empregaram usando a administração de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação das principais veias da retina com um laser. No entanto, a quantidade e o tipo de corante que é administrado, a potência do laser e o tempo de exposição variam significativamente entre os estudos que usaram esse método. Essas diferenças muitas vezes podem levar ao aumento da variabilidade no modelo, dificultando a replicação. Até o momento, não há estudos publicados com detalhes específicos sobre possíveis caminhos para sua otimização.

Este relato apresenta uma metodologia detalhada do modelo de camundongo RVO na cepa C57BL/6J e uma cepa caspase-9 endotelial induzível por tamoxifeno (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J e de relevância para a patologia RVO como cepa de referência para um camundongo geneticamente modificado. Estudo prévio havia demonstrado que a ativação não apoptótica da caspase-9 endotelial instiga edema retiniano e promove morte neuronal⁸. A experiência usando essa cepa ajudou a determinar e fornecer informações sobre possíveis modificações para adaptar o modelo de camundongo RVO, que pode ser aplicável a outras cepas geneticamente modificadas.

Protocol

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia. NOTA: Todos os experimentos usaram camundongos machos de dois meses de idade que pesavam aproximadamente 20 g. 1. Preparação e administração de tamoxifeno para abla…

Representative Results

O modelo de camundongo RVO visa alcançar com sucesso oclusões nas veias da retina, levando a lesão hipóxico-isquêmica, quebra da barreira hemato-retiniana, morte neuronal e edema de retina8. A Figura 1 mostra uma linha do tempo de etapas para garantir a reprodutibilidade, um esquema do desenho experimental e descreve as etapas que podem ser otimizadas dependendo das questões experimentais. As três etapas principais que podem ser modificadas são o tempo de espe…

Discussion

O modelo RVO de camundongo fornece um caminho para entender melhor a patologia do RVO e testar possíveis terapêuticas. Embora o modelo RVO do mouse seja amplamente utilizado no campo, há a necessidade de um protocolo detalhado atual do modelo que aborde sua variabilidade e descreva a otimização do modelo. Aqui, fornecemos um guia com exemplos da experiência sobre o que pode ser alterado para obter os resultados mais consistentes em uma coorte de animais experimentais e fornecer dados confiáveis.

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Materials

Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20