ड्रोसोफिला में घ्राण सर्किट असेंबली के टाइम-लैप्स इमेजिंग अध्ययन के लिए एक स्पष्टीकरण प्रणाली
Summary
यह प्रोटोकॉल विच्छेदन प्रक्रिया, संस्कृति की स्थिति, और घ्राण सर्किट असेंबली के अध्ययन के लिए एक एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण प्रणाली की लाइव इमेजिंग का वर्णन करता है।
Abstract
~ न्यूरॉन्स मस्तिष्क के उचित कार्य के लिए आवश्यक सर्किट बनाने के लिए ठीक से जुड़े हुए हैं। ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली इस प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है क्योंकि एंटीना और मैक्सिलरी पाल्प्स से 50 प्रकार के घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) अपने अक्षतंतुओं को एंटीनेल लोब में 50 पहचानयोग्य ग्लोमेरुली में प्रोजेक्ट करते हैं और 50 प्रकार के दूसरे-क्रम के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) से डेंड्राइट्स के साथ सिनैप्टिक कनेक्शन बनाते हैं। पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया जो निश्चित ऊतकों का उपयोग करके घ्राण सर्किट में सटीक लक्ष्यीकरण को विनियमित करते हैं। यहां, एक एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण प्रणाली जो संस्कृति में घ्राण सर्किट असेंबली के प्रमुख विकासात्मक मील के पत्थर को दोहराती है, का वर्णन किया गया है। बाहरी छल्ली को विच्छेदन करने और विकासशील प्यूपल मस्तिष्क को कवर करने वाले अपारदर्शी वसा निकायों की सफाई के माध्यम से, जीवित दिमाग से एकल न्यूरॉन्स की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है। यह लाइव ऊतक से एकल ओआरएन अक्षतंतु लक्ष्यीकरण के समय-अंतराल इमेजिंग की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण सेल जैविक संदर्भों और पहले से पहचाने गए महत्वपूर्ण जीनों के कार्यों को प्रकट करने में मदद करेगा और सर्किट असेंबली की गतिशील प्रक्रिया को रेखांकित करने वाले तंत्र की पहचान करेगा।
Introduction
न्यूरॉन्स मस्तिष्क के उचित कार्य के लिए आवश्यक सर्किट बनाने के लिए ठीक से जुड़े हुए हैं। 100 से अधिक वर्षों के लिए, न्यूरोसाइंटिस्ट यह समझने की कोशिश कर रहे हैं कि न्यूराइट्स अत्यधिक सटीकता के साथ अपने मध्यवर्ती और अंतिम लक्ष्यों की ओर कैसे विस्तार करते हैं। नतीजतन, उन्होंने महत्वपूर्ण जीनों की पहचान की है जो न्यूरोनल प्रक्रियाओं के विकास के लिए मार्गदर्शन संकेतों को एन्कोड करतेहैं। ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली इस प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है क्योंकि घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन, प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स) रूढ़िवादी आकार, आकार और सापेक्ष स्थिति के साथ 50 पहचानयोग्य ग्लोमेरुली को प्रोजेक्ट करते हैं, जहां वे 50 प्रकार के दूसरे-क्रम प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) से डेंड्राइट्स के साथ सिनैप्टिक कनेक्शन बनाते हैं, जिनमें से प्रत्येक 50 ग्लोमेरुली2 (चित्रा 1 ए) में से एक में डेंड्राइट्स भेजता है ।। ). इसलिए, फ्लाई घ्राण प्रणाली में सिनैप्टिक (ग्लोमेरुलर) रिज़ॉल्यूशन पर उत्परिवर्ती फेनोटाइप की पहचान करना अपेक्षाकृत आसान है। इसने महत्वपूर्ण जीनों की खोजों को जन्म दिया जो घ्राण सर्किट असेंबली 3 को विनियमित करतेहैं।
फ्लाई घ्राण परिपथ की असेंबली अस्थायी और स्थानिक रूप से समन्वित विकास प्रक्रियाओं पर निर्भर करतीहै। ORNs और PNs अलग-अलग सेल fates प्राप्त करते हैं, जो उनकी तारों की विशिष्टताओं के लिए कार्यक्रम स्थापित करते हैं। अगला, पीएन डेंड्राइट्स एंटीनेल लोब (चित्रा 1 बी) को प्रीपैटर्न करते हैं। ORNs के अक्षतंतु तब ipsilateral एंटीनाल लोब का चक्कर लगाते हैं और contralateral एंटीनाल लोब तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क की मध्य रेखा को पार करते हैं। इसके बाद, ORN अक्षतंतु ipsi- और contralateral एंटीनाल लोब दोनों पर आक्रमण करते हैं और विशिष्ट ग्लोमेरुली में अपने साथी PNs के डेंड्राइट्स के साथ synapses बनाते हैं। घ्राण सर्किट असेंबली के लिए यह मोटा मॉडल विकास के दौरान मध्यवर्ती समय बिंदुओं से निश्चित नमूनों के लक्षण वर्णन के आधार पर प्रस्तावित किया गया था। गरीब अस्थायी संकल्प और निश्चित ऊतक से विकास के पार एक ही न्यूरोनल प्रक्रियाओं का पालन करने में असमर्थता सर्किट असेंबली प्रक्रिया की यांत्रिक समझ को सीमित करती है।
यह तकनीकी रूप से वीवो में लाइव छवि ओआरएन और पीएन प्रक्रियाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वायरिंग प्रक्रिया प्यूपल चरण की पहली छमाही में होती है जब एंटीनेल लोब प्यूपल मामले के अंदर अपारदर्शी वसा शरीर से घिरा होता है। इसलिए, बरकरार प्यूपे से विकासशील घ्राण सर्किट को सीधे छवि बनाना असंभव है। विच्छेदित ऊतक सुसंस्कृत पूर्व विवो ऊतक अस्पष्टता को दरकिनार कर सकते हैं और सफलतापूर्वक तंत्रिका विकास 4,5,6 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। प्यूपल मस्तिष्क में न्यूरोनल वायरिंग का अध्ययन करने के लिए एक समान पूर्व विवो स्पष्टीकरण संस्कृति रणनीति का उपयोग करने की चुनौती यह है कि क्या यह एक संस्कृति की स्थिति में सटीक न्यूरॉन लक्ष्यीकरण को दोहराता है। फ्लाई आई-ब्रेन कॉम्प्लेक्स7 के लिए पहले से रिपोर्ट की गई पूर्व विवो संस्कृति की स्थिति के आधार पर, एक स्पष्टीकरण जिसमें पूरे प्यूपल मस्तिष्क, एंटीना और कनेक्टिंग एंटेना नसों को बरकरार रखा गया है, को हाल ही में विकसित किया गया है, जो घ्राण सर्किट के सटीक लक्ष्यीकरण को बरकरार रखता है और हर 20 मिनट की आवृत्ति पर 24 घंटे तक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी-आधारित लाइव इमेजिंग के अधीन किया जा सकताहै। . यहां, स्पष्टीकरण संस्कृति और इमेजिंग के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। स्पष्टीकरण प्रणाली केंद्रीय मस्तिष्क में घ्राण सर्किट और संभावित रूप से अन्य सर्किटों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला एंटीना-मस्तिष्क स्पष्टीकरण घ्राण सर्किट के सामान्य लक्ष्यीकरण को बरकरार रखता है। हमने देखा कि विकास विवो की तुलना में 2 गुना धीमा पूर्व वीवो है। यह ध्यान दिया जाता है कि स्पष्टीक…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एन Özel और आर Hiesinger स्पष्टीकरण संस्कृति पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद; दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी की तकनीकी सहायता के लिए एम वैगनर; ट्रांसजेनिक मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए डीजे लुगिनबुहल; फिजी सॉफ्टवेयर विश्लेषण के सुझावों के लिए डी फ्रीडमैन; मक्खी के काम पर सहायता के लिए Y. Ge; C. McLaughlin और K.K.L. वोंग पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए। एलएल एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान 1K99DC01883001 (T.L.) और R01-DC005982 (L.L. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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