Et explant-system for tidsforløpavbildningsstudier av olfaktorisk kretsmontering i Drosophila

Summary

Denne protokollen beskriver disseksjonsprosedyren, kulturtilstanden og levende avbildning av et antenne-hjerne-utvisningssystem for studiet av den olfaktoriske kretsenheten.

Abstract

~ Nevroner er nøyaktig sammenkoblet for å danne kretser som er avgjørende for riktig funksjon av hjernen. Drosophila olfaktorisk system gir en utmerket modell for å undersøke denne prosessen siden 50 typer olfaktoriske reseptor neuroner (ORNer) fra antennene og maxillary palps projisere sine aksoner til 50 identifiserbare glomeruli i antenneloben og danne synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andreordens projeksjons neuroner (PN). Tidligere studier fokuserte hovedsakelig på å identifisere viktige molekyler som regulerer den nøyaktige målrettingen i den olfaktoriske kretsen ved hjelp av faste vev. Her beskrives et antenne-hjerne-explant-system som rekapitulerer viktige utviklingsmilepæler av olfaktorisk kretsmontering i kulturen. Gjennom dissekering av ytre kutikal og rengjøring av ugjennomsiktige fettlegemer som dekker den utviklende pupalhjernen, kan bilder av høy kvalitet av enkeltnevroner fra levende hjerner samles ved hjelp av to-fotonmikroskopi. Dette tillater tidsforløpavbildning av enkel ORN axon-målretting fra levende vev. Denne tilnærmingen vil bidra til å avdekke viktige cellebiologiske sammenhenger og funksjoner til tidligere identifiserte viktige gener og identifisere mekanismer som ligger til grunn for den dynamiske prosessen med kretsmontering.

Introduction

Nevroner er nøyaktig sammenkoblet for å danne kretser som er avgjørende for riktig funksjon av hjernen. I over 100 år har nevrologer forsøkt å forstå hvordan nevritter strekker seg mot deres mellomliggende og endelige mål med ekstrem presisjon. Som et resultat har de identifisert viktige gener som koder veiledningssignaler for å utvikle nevronprosesser¹. Drosophila olfaktorisk system gir en utmerket modell for å undersøke denne prosessen siden olfaktoriske reseptor neuroner (ORNer, de primære sensoriske nevroner) prosjektet til 50 identifiserbare glomeruli med stereotypisk størrelse, form og relativ posisjon, hvor de danner synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andre ordens projeksjon neuroner (PN), som hver sender dendritter til en av de 50 glomeruli² (Figur 1 ). Derfor er det relativt enkelt å identifisere mutantfenotyper ved synaptisk (glomerulær) oppløsning i fly olfaktorisk system. Dette førte til funn av viktige gener som regulerer olfaktorisk kretsmontering³.

Monteringen av fly olfaktorisk krets er avhengig av temporally og romlig koordinerte utviklingsprosesser³. ORNer og PNer får distinkte celle skjebner, som satte opp programmet for sine ledningsspesifikasjoner. Deretter prepatnerer PN antenneloben (figur 1B). Axonene til ORNs omskjærer deretter den ipsilaterale antenneloben og krysser midtlinjen i hjernen for å nå den kontralaterale antenneloben. Deretter invaderer ORN-axoner både ipsi- og kontralaterale antennelober og danner synapser med dendritter av partner-PN-ene sine i spesifikk glomeruli. Denne grove modellen for olfaktorisk kretsmontering ble foreslått basert på karakterisering av faste prøver fra mellomliggende tidspunkter under utviklingen. Den dårlige temporale oppløsningen og manglende evne til å følge de samme nevronale prosessene på tvers av utvikling fra fast vev begrenser den mekanistiske forståelsen av kretsmonteringsprosessen.

Det er teknisk utfordrende å live image ORN og PN prosesser in vivo siden ledningsprosessen skjer i første halvdel av puppetrinnet når antenneloben er omgitt av ugjennomsiktig fettlegeme inne i puppetuiet. Det er derfor umulig å direkte avbilde den utviklende olfaktoriske kretsen fra intakt pupper. Dissekert vev dyrket ex vivo kan omgå vev opasitet og har blitt vellykket brukt til å studere nevral utvikling ^4,5,6. Utfordringen med å bruke en lignende ex vivo explant kulturstrategi for å studere nevronale ledninger i pupalhjernen er om den rekapitulerer den presise nevronmålrettingen i en kulturtilstand. Basert på en tidligere rapportert ex vivo-kulturtilstand for fly eye-brain-komplekset⁷, har en utvisning som inneholder hele pupalhjernen, antennene og de tilkoblede antennenervene intakt nylig blitt utviklet, som beholder presis målretting av den olfaktoriske kretsen og kan bli utsatt for to-fotonmikroskopibasert levende bildebehandling i opptil 24 timer ved frekvensen av hver 20 min⁸ . Her beskrives en detaljert protokoll for utvisningskulturen og avbildningen. Explant-systemet gir en kraftig metode for å studere montering av olfaktorisk krets og potensielt andre kretser i den sentrale hjernen.

Protocol

1. Utarbeidelse av reagenser MERK: Alle trinnene i denne protokollen utføres ved romtemperatur (20-25 °C) med mindre annet er forklart. For å klargjøre kulturretten for å immobilisere utløpet under tidsforløpavbildning, legg 0,5 cm tykk Sylgard (bland grundig to flytende komponenter ved 10:1-forholdet før bruk) på undersiden av en 60 mm x 15 mm Petri-tallerken og la den kurere i 48 timer ved romtemperatur (figur 2A, referert til…

Representative Results

ORN-axoner ankommer antenneloben mellom 18 timer og 36 timer APF. Deretter navigerer de i antenneloben, krysser midtlinjen og innervater glomerulien. Video 1 er en representativ video som viser hele prosessen for flere individuelt identifiserbare aksoner, tatt med frekvensen av hver 20 min i 24 timer. Før registrering ved hjelp av TurboReg, viser axonene noen laterale drifting som hjernen utvikler (første halvdel av videoen). Etter registrering korrigeres driften (andre halvdel av videoen). <p clas…

Discussion

Drosophila-antennehjernen beholder normal målretting av den olfaktoriske kretsen. Vi la merke til at utviklingen er 2 ganger langsommere ex vivo sammenlignet med in vivo. Det bemerkes at explant-systemet ikke beholder maksillær palp, som er vert for seks typer ORNer. For å sikre normal utvikling er recapitulated ex vivo, strekker antenne nerver må unngås under explant disseksjon. Under ex vivo kultur forårsaker bakterievekst vanligvis arrestert utvikling av den olfaktori…

Materials

20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000