Målet med detta protokoll är att rikta cell vidhäftning och tillväxt till riktade områden av rutnät för kryoelektronmikroskopi. Detta uppnås genom att applicera ett antifoulingskikt som ableras i användarspecificerade mönster följt av deponering av extracellulära matrisproteiner i de mönstrade områdena före cellsådd.
Helcellig kryoelektrontomografi (cryo-ET) är en kraftfull teknik som används för att producera nanometernivåupplösningsstrukturer av makromolekyler som finns i cellulära sammanhang och bevaras i ett nästan inbyggt frusethydratiserat tillstånd. Det finns dock utmaningar förknippade med odling och/eller vidhäftning av celler på TEM-rutnät på ett sätt som är lämpligt för tomografi samtidigt som cellerna behålls i deras fysiologiska tillstånd. Här presenteras ett detaljerat steg-för-steg-protokoll om användningen av mikropapper för att styra och främja eukaryota celltillväxt på TEM-nät. Under mikropapper riktas celltillväxten genom att deponera excellulära matrisproteiner (ECM) inom angivna mönster och positioner på folien i TEM-rutnätet medan de andra områdena förblir belagda med ett antifoulingskikt. Flexibilitet i valet av ytbeläggning och mönsterdesign gör mikropapper i stort sett tillämpligt för ett brett spektrum av celltyper. Mikropapper är användbart för studier av strukturer inom enskilda celler samt mer komplexa experimentella system som värdpatogeninteraktioner eller differentierade multicellulära samhällen. Mikropapper kan också integreras i många nedströms helcells cryo-ET-arbetsflöden, inklusive korrelativt ljus och elektronmikroskopi (cryo-CLEM) och fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB).
Med utvecklingen, expansionen och mångsidigheten hos kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har forskare undersökt ett brett spektrum av biologiska prover i ett nästan inhemskt tillstånd från makromolekylär (~ 1 nm) till hög (~ 2 Å) upplösning. Cryo-EM- och elektrondiffraktionstekniker med en partikel tillämpas bäst på renade makromolekyler i lösning eller kristallint tillstånd, respektive1,2. Medan kryoelektrontomografi (cryo-ET) är unikt lämpad för nästan inhemska strukturella och strukturella studier av stora, heterologa föremål som bakterier, pleomorfa virus och eukaryota celler3. I kryo-ET erhålls tredimensionell (3D) information genom att fysiskt luta provet på mikroskopstadiet och förvärva en serie bilder genom provet i olika vinklar. Dessa bilder, eller tilt-serien, täcker ofta ett intervall på +60/-60 grader i steg om en till tre grader. Tilt-serien kan sedan omvandlas beräkningsmässigt till en 3D-volym, även känd som ett tomogram4.
Alla kryo-EM-tekniker kräver att provet är inbäddat i ett tunt lager av amorf, icke-kristallin, glasaktig is. En av de vanligaste kryofixeringsteknikerna är dykfrysning, där provet appliceras på EM-nätet, blottas och snabbt kastas in i flytande etan eller en blandning av flytande etan och propan. Denna teknik är tillräcklig för vitrifikation av prover från <100 nm till ~ 10 μm i tjocklek, inklusive odlade mänskliga celler, såsom HeLa-celler5,6. Tjockare prover, såsom miniorganoider eller vävnadsbiopsier, upp till 200 μm i tjocklek, kan vitrifieras genom högtrycksfrysning7. Men på grund av ökad elektronspridning av tjockare prover är prov- och istjockleken för cryo-ET begränsad till ~ 0,5 – 1 μm i 300 kV transmissionselektronmikroskop. Därför är helcells cryo-ET av många eukaryota celler begränsad till cellens periferi eller förlängningar av celler om inte ytterligare provberedningssteg används, såsom kryosektion8 eller fokuserad jonstråle fräsning9,10,11.
En begränsning av många helcells cryo-ET-avbildnings experiment är datainsamling genom flöde12. Till skillnad från enpartikel cryo-EM, där tusentals isolerade partiklar ofta kan avbildas från en enda TEM-rutnät kvadrat, celler är stora, utspridda och måste odlas med tillräckligt låg densitet för att cellerna ska kunna bevaras i ett tunt lager av glasaktig is. Ofta är den intressanta regionen begränsad till en viss funktion eller underområde i cellen. Ytterligare begränsande dataflöde är cellernas benägenhet att växa på områden som inte är mottagliga för TEM-avbildning, till exempel på eller nära TEM-rutnätsstaplar. På grund av oförutsägbara faktorer i samband med cellkultur på TEM-nät behövs teknisk utveckling för att förbättra urvalets tillgänglighet och genomströmning för datainsamling.
Substratmikrutnätning med vidhäftande excellulära matrisproteiner (ECM) är en väletablerad teknik för levande cellljusmikroskopi för att styra tillväxten av celler på styva, hållbara och optiskt transparenta ytor som glas och andra vävnadsodlingssubstrat13,14. Micropatterning har också utförts på mjuka och/eller tredimensionella (3D) ytor. Sådana tekniker har inte bara gjort det möjligt att exakt placera celler. De har också stött skapandet av multicellulära nätverk, såsom mönstrade neurala cellkretsar15. Att föra mikropapper till cryo-ET kommer inte bara att öka genomströmningen, men det kan också öppna upp nya studier för att utforska komplexa och dynamiska cellulära mikromiljö.
Nyligen har flera grupper börjat använda mikropapperstekniker på TEM-rutnät genom flera tillvägagångssätt16,17. Här beskrivs användningen av en masklös fotopappersteknik för TEM-galler med hjälp av Alvéole PRIMO mikropapperssystem, som har högupplöst och kontaktlös mönstra. Med detta mikropapperssystem appliceras ett antifoulingskikt på toppen av substratet, följt av applicering av en fotokatalys och ablation av anti-fouling-skiktet i användardefinierade mönster med en UV-laser. ECM-proteiner kan sedan tillsättas till mönstren för lämplig cellkultur. Denna metod har använts av flera grupper för cryo-ET studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hund njure-II (MDCKII), humant förhud fibroblast (HFF) och endotel cellinjer16,17,18. Detta mikropapperssystem är kompatibelt med flera antifoulingskiktssubstrat samt antingen en flytande eller gel photocatalyst reagens. En mängd olika ECM-proteiner kan väljas från och anpassas för cellinjens specificitet, vilket ger mångsidighet för användaren.
Micropatterning har framgångsrikt tillämpats på ett antal projekt inom laboratoriet19. Här presenteras ett mikropatterning protokoll, inklusive specifika anpassningar för att studera odlade HeLa celler, respiratory syncytial virus (RSV)-infekterade BEAS-2B celler och primära larval Drosophila melanogaster nervceller20.
Moderna, avancerade elektronmikroskop och programvarupaket stöder nu strömlinjeformad automatiserad kryo-EM och kryo-ET datainsamling där hundratals till tusentals positioner kan riktas och avbildas inom några dagar32,33,34,35. En viktig begränsande faktor för helcelliga kryo-ET-arbetsflöden har varit att få tillräckligt många insamlingsbara mål per rutnät. Nyligen har ett antal grupper utvecklat protokoll för mikropappersnät för cryo-EM, med en fördel som förbättrad datainsamlingseffektivitet16,17,18. Här presenteras ett protokoll för att använda ett kommersiellt tillgängligt mikropapperssystem till mikromönster TEM-rutnät för cryo-ET-studier av primära Drosophila-nervceller och odlade mänskliga cellinjer (oinfekterade eller RSV-infekterade). Detta mikropapperssystem är mångsidigt och många steg kan optimeras och skräddarsys för att passa specifika experimentella mål. En användare med TEM- och fluorescensmikroskopi erfarenhet kan snabbt bli skicklig på nätberedning och mikropatterning. Med noggrann praxis bör goda resultat uppnås efter några iterationer. Nedan diskuteras några av de tillgängliga alternativen, användaröverväganden, potentiella fördelar och framtida tillämpningar av mikropatterning för cryo-EM.
En av de viktiga övervägandena för hela cell cryo-ET är EM-rutnätsval. EM-galler består av två delar: en maskram (eller strukturellt stöd) och folien (eller filmen), som är den kontinuerliga eller håliga filmytan på vilken cellerna kommer att växa. Kopparnätnät används ofta för kryo-EM av proteiner och isolerade komplex. De är dock olämpliga för helcells cryo-ET på grund av kopparns cytotoxicitet. Istället används ett guldnät ofta för cellulär tomografi. Andra alternativ inkluderar nickel eller titan, vilket kan ge fördelar jämfört med guld som ökad styvhet16. EM-nät finns med olika nätdimensioner för att stödja en rad olika applikationer. Större maskstorlekar ger mer utrymme för celler att växa mellan gallerstänger och fler områden som är mottagliga för insamling av tiltserier, men på bekostnad av ökad övergripande provskörhet. Den vanligaste folien är perforerat eller håligt amorft kol, såsom Quantifoils eller C-platta galler. Biologiska mål kan avbildas antingen genom hålen i kolet eller genom det elektrontranslucenta kolet. Galler som R 2/1 eller R 2/2, där hålen är 2 μm breda och som är åtskilda 1 respektive 2 μm, ger ett stort antal hål och därmed ett stort antal potentiella områden för datainsamling. Vissa celler kan dock växa och expandera bättre på mer enhetliga ytor som R 1.2/20-nät eller kontinuerligt kol. För nedströms provbearbetning genom fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB) avlägsnas folien genom fräsning, vilket minskar oron för den underliggande filmens fortsatta förekomst. Precis som med nätet finns även folier från andra material, där mönseringsprotokollet som presenteras här är lika lämpligt för SiO2-galler . Vanliga rutnät inkluderar guld Quantifoil, kontinuerligt kol eller SiO2 film 200-mesh rutnät (~ 90 μm avstånd mellan galler barer) för helcell cryo-ET.
Det finns ett antal överväganden när du utformar ett mönster. En majoritet av dessa beslut styrs av experimentets celltyp och syfte. En bra utgångspunkt är att välja ett mönster som approximerar cellernas form och dimensioner i kulturen. Många studier har visat betydande effekter av mönsterform på celltillväxt och cytoskeletal arrangemang13,36,37. Särskild försiktighet bör iakttas under mönsterdesignen om detta kan ändra målet av intresse. Flera mönster för varje celltyp testades för att avgöra vilka mönster främjas cellulär vidhäftning och tillväxt. Flexibiliteten i mikropapperssystemet gör det möjligt att testa flera mönster i ett enda rutnät och ändra mönster för olika rutnät inom ett enda experiment. Större mönster (~ 50-90 μm), såsom de som används här, ökar sannolikheten för att flera celler håller sig till en enda region i mönstret och tillåter celler att expandera och förlänga efter vidhäftning. Mer begränsade mönster (20-30 μm) kan vara lämpliga i experiment där cellisolering är mer kritisk än cellexpansion, t.ex. för experiment med kryo-FIB(focused-jon beam milling). För tomografitillämpningar kan man behöva överväga lutningsaxelns inverkan. Om ett mönster är placerat så att alla celler växer parallellt med varandra i en enda riktning, är det möjligt att alla celler kommer att vara vinkelräta mot lutningsaxeln när de laddas på mikroskopstadiet, vilket resulterar i en lägre datakvalitet.
På icke-upprutade rutnät håller cellerna ofta företrädesvis vid rutnätsstaplarna, där de inte kan avbildas av TEM. Även på mönstrade galler observeras celler ofta placeras i hörnen av rutnätsrutor delvis på både den mönstrade kolfolien och gallerstången. Nyligen användes micropatterning för att avsiktligt placera en del av cellen över rutnätsfältet18. Detta kan övervägas för experiment där det inte är viktigt att ha hela cellens periferi på folien. Detta kan vara särskilt viktigt för celler som kan växa större än en enda rutnät kvadrat, såsom primära nervceller växer under flera dagar.
Det finns många verktyg som kan användas för att utforma ett mönster. Här var mönstret begränsat till mindre än 800 pixlar i en dimension så att mönstret kan roteras till vilken vinkel som helst och fortfarande passa inom det maximala området som kan mönstras i en enda projektion av detta mikropatterningssystem. Detta gör det möjligt för användaren att rotera mönstret för att vara korrekt orienterad med rutnätet oavsett orienteringen av rutnätet på mikroskopet. Här delades rutnätet in i sex mönstrar. I första hand möjliggör detta fokusjustering mellan olika regioner i rutnätet. Särskilt guldgaller är mycket formbara och får inte lägga sig helt platt på glaset. Rätt fokus är viktigt för rena, raffinerade mönstrar. Genom att använda segmenterade mönster behöver endast mindre justeringar av mönsterpositionen göras om rutnätet skiftar något under mönstningsprocessen, även om detta vanligtvis inte är ett problem när du använder PLPP-gelén med PDMS-stencilerna. Slutligen förblev de centrala fyra rutnätsrutorna i rutnätet oförändrade. Detta stöder en användare som tydligt kan identifiera mitten av rutnätet, vilket är mycket användbart för korrelativa avbildningsexperiment.
Mönskningsprogramvaran för detta mikropapperssystem, Leonardo, har också mer avancerade funktioner som sömnad och möjligheten att importera mönster som PDF-filer, som ligger utanför detta protokoll. Denna programvara innehåller också mikrostrukturdetektering och automatiserad mönsterpositionering som kan användas på TEM-nät. Den här funktionen är mest användbar när rutnätet är mycket platt och kan mönstras utan att behöva justera fokus mellan olika områden.
Val av ett ECM-protein kan ha en betydande inverkan på cell vidhäftning och expansion. Vissa celler är kända för att genomgå fysiologiska förändringar när de odlas på specifika substrat38. Flera ECM-proteiner och koncentrationer testades för någon ny celltyp baserat på tidigare arbete som rapporterats i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin och kollagen används ofta för odlade celler och kan användas som utgångspunkt om andra data inte är tillgängliga. Andra ECM-proteiner måste dock också övervägas om de vanliga ECM-proteinerna inte ger cellerna korrekta vidhäftande egenskaper. Detta var särskilt sant för primära Drosophila nervceller, som en hög koncentration av växten lectin concanavalin A var nödvändigt för korrekt cellulära adherence. Kompatibiliteten hos cellulär vidhäftning och tillväxt med ECM kan testas genom mönstra på glasfat eller diabilder innan de övergår till TEM-galler. Denna förundersökningsmetod är tids- och kostnadseffektiv om ett stort antal kombinationer behöver undersökas. Införandet av ett fluorescerande konjugerat ECM-protein är värdefullt för att bedöma framgången och kvaliteten på mönstrar.
Cellsådd är ett av de viktigaste stegen för hela cell cryo-ET, antingen med eller utan mikropapper6,16,39. För primära Drosophila eller andra nervceller, som är bräckliga, instabila i suspension och kan begränsas i kvantitet, föredras enstaka såddmetoder framför övervakad, sekventiell cellsådd. Ett enda såddsteg vid en optimerad celldensitet, som beskrivs i protokollet för Drosophila-nervceller, är ett genomförbart alternativ för de flesta celltyper. Det är dock också möjligt att så celler på substratet vid en lägre initial koncentration och lägga till fler celler på ett övervakat sätt som beskrivs här och i annan litteratur18. Denna sekventiella sådd kan ge mer konsekventa resultat i vissa fall. I likhet med standardcellskultur bör man alltid vara noga med att upprätthålla cellens livskraft och minimera cellklumpning under isolering.
När du först börjar med mikropapperning finns det några potentiella fallgropar som är skadliga för slutresultatet. Noggrann näthantering och steril teknik, en enhetlig fördelning av PLPP-gelen, korrekt dos och fokus under mönstraring och underhåll av cellens livskraft före sådd är bland de viktigaste övervägandena för framgång. En förteckning över några av de potentiella problemen och lösningarna sammanställdes i tabell 1.
Mikromönster kan användas för att positionera celler för att upprätta en konsekvent celltäthet över rutnätet och för att placera områden av intresse i områden som är lämpliga för insamling av tiltserier16,18. Placering och placering av celler kan användas som fiducial markörer för korrelation i cryo-CLEM experiment, vilket minskar behovet av bräckliga finder-grids och fluorescerande fiducial markörer. Det bör dock noteras att sådana fiducial markörer fortfarande kan vara användbara för korrelationen med submikrometernoggrannhet29,40. Dessutom är en jämn fördelning av isolerade celler också mycket fördelaktig för experiment-jonstrålefräsning (cryo-FIB) experiment för att maximera antalet celler från vilka lameller kan skäras16.
Tillägget av mikropapper till kryo-EM-arbetsflöden kommer att resultera i mätbara förbättringar av datagenomströmningen och potentiellt möjliggöra nya experiment. När tekniken antas och utvecklas ytterligare kommer mer avancerade tillämpningar av mikropapper, inklusive ECM-gradienter, flera ECM-deponering och mikrostrukturmontering, att ytterligare utöka kryo-ET: s kapacitet att studera biologiska mål och processer i fullständigt cellulärt sammanhang.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang och Mrs. Josephine W. Mitchell vid institutionen för biokemi, University of Wisconsin, Madison för att generöst dela elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flugstam (Bloomington stock center, #5146). Vi vill också tacka Dr. Aurélien Duboin, Laurent Siquier och Marie-Charlotte Manus från Alvéole och Serge Kaddoura från Nanoscale Labs för deras generösa stöd under detta projekt. Detta arbete stöddes delvis av University of Wisconsin, Madison, Institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison och folkhälsobidrag R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 och U24 GM139168 till E.R.W. och R01 AI150475 till P.W.S. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslag U24 GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Vi är också tacksamma för användningen av faciliteter och instrumentering vid Cryo-EM Research Center vid institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison.
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | |
0.22 µm syringe filters PVDF membrane | Genesee | 25-240 | |
22×60-1 Glass cover slip | Fisher | 12545F | |
5/15 Tweezers | EMS (Dumont) | 0203-5/15-PO | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher (Gibco) | 15240096 | |
BEAS-2B cells | ATCC | CRL-9609 | |
Collagen I, bovine | ThermoFisher (Gibco) | A1064401 | |
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | C11254 | |
DMEM | Fisher (Lonza) | BW12-604F | |
EtOH | Fisher (Decon Labs) | 22-032-600 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | F35200 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher (Gibco) | 33010018 | |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Glucose | VWR | 0643-1KG | |
Grid prep holder | EMS | 71175-01 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
Hemacytometer | Fisher (SKC, Inc.) | 22600100 | |
HEPES | Fisher (ACROS Organics) | AC172572500 | |
Hoechst 33342 | ThermoFisher (Invitrogen) | H3570 | |
Insulin | Fisher (Sigma Aldrich) | NC0520015 | |
KCl | MP Bio | 194844 | |
KH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC212595000 | |
Leica-DMi8 | Leica Microsystems | Can be customized with camera, stage, and objective attachments | |
Leonardo | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ | |
Liberase Research Grade | Fisher (Supply Solutions) | 50-100-3280 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | ThermoFisher (Invitrogen) | L3224 | |
Microscope camera | Hammamatsu | C13440-20CU | |
Motorized stage | Märzhäuser Wetzlar | 00-24-599-0000 | |
NaCl | Fisher (Fisher BioReagents) | BP358-1 | |
NaH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC207802500 | |
NaOH | Fisher (Alfa Aesar) | AAA1603736 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PDMS stencils | nanoscaleLABS | PDMS_STENCILS_EM | https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/ |
PEG-SVA | nanoscaleLABS | PEG-SVA-1GR | mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 |
Penicillin | Fisher (Research Products International Corp) | 50-213-641 | |
pH strips | Fisher (Millipore Sigma) | M1095350001 | pH probe can also be used |
PLPP gel | nanoscaleLABS | PLPP-GEL-300UL | https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/ |
PRIMO | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/ | |
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) | BEI Resources | NR-36460 | https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx |
Quantifoil grids | EMS (Quantifoil) | Q2100AR1 | 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available |
RPMI | Fisher (Lonza) | BW12-702F | |
RSV A2-mK+ | see entry for pSynkRSV-19F | – | Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F |
Schneider's Media | ThermoFisher (Gibco) | 21720-024 | |
SerialEM | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | |
Straight tweezers | EMS (Dumont) | 72812-D | |
Streptomycin | Fisher (Fisher BioReagents) | BP910-50 | |
Sucrose | Avantor | 4097-04 | |
Tetracycline | Sigma | T8032-10MG | |
Titan Krios electron microscope | ThermoFisher | 300kV, with direct electron detector camera and energy filter | |
Trypsin | ThermoFisher (Gibco) | 15090046 | |
Tube Revolver/Rotator | Fisher (Thermo Scientific) | 11676341 | |
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain | Bloomington Drosophila Stock Center | 5146 | http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html |