सुसंस्कृत हड्डी कोशिकाओं और पृथक हड्डी शाफ्ट में अमीनो एसिड की खपत का मूल्यांकन
Summary
यह प्रोटोकॉल एक रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक परख प्रस्तुत करता है, जो प्राथमिक कोशिकाओं या पृथक हड्डियों में अमीनो एसिड की खपत का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है।
Abstract
हड्डी का विकास और होमियोस्टेसिस अस्थि निर्माण ओस्टियोब्लास्ट के भेदभाव और गतिविधि पर निर्भर है। ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव क्रमिक रूप से प्रोटीन संश्लेषण और अंततः हड्डी मैट्रिक्स स्राव के बाद प्रसार की विशेषता है। प्रसार और प्रोटीन संश्लेषण के लिए अमीनो एसिड की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है। इसके बावजूद, ओस्टियोब्लास्ट में अमीनो एसिड की खपत के बारे में बहुत कम जानकारी है। यहां हम एक बहुत ही संवेदनशील प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे रेडियोलेबल अमीनो एसिड का उपयोग करके अमीनो एसिड की खपत को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस विधि को अमीनो एसिड अपटेक में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो ओस्टियोब्लास्ट प्रसार या भेदभाव, दवा या विकास कारक उपचार, या विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़ से जुड़े हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि का उपयोग सुसंस्कृत सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं में एमिनो एसिड की खपत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, हमारी विधि को आसानी से अमीनो एसिड के परिवहन के साथ-साथ ग्लूकोज और अन्य रेडियोलेबल पोषक तत्वों को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
अमीनो एसिड कार्बनिक यौगिक होते हैं जिनमें एक परिवर्तनीय साइड चेन के साथ एक एमिनो (-एनएच2) और कार्बोक्सिल (-सीओओएच) कार्यात्मक समूह होते हैं जो प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए विशिष्ट होते हैं। सामान्य तौर पर, अमीनो एसिड प्रोटीन के मूल घटक के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है। हाल ही में, अमीनो एसिड के नए उपयोग और कार्यों को स्पष्ट किया गया है। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत अमीनो एसिड को मध्यवर्ती मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करने के लिए चयापचय किया जा सकता है जो बायोएनर्जेटिक में योगदान करते हैं, एंजाइमेटिक कोफ़ैक्टर्स के रूप में कार्य करते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को विनियमित करते हैं या अन्य अमीनो एसिड को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . कई अध्ययनों से पता चलता है कि अमीनो एसिड चयापचय विभिन्नसंदर्भों में सेल प्लूरिपोटेंसी, प्रसार और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है 3,6,11,12,13,14,15,16,17।
ओस्टियोब्लास्ट स्रावी कोशिकाएं हैं जो कोलेजन टाइप 1 समृद्ध बाह्य अस्थि मैट्रिक्स का उत्पादन और स्राव करती हैं। हड्डी के गठन के दौरान प्रोटीन संश्लेषण की उच्च दर को बनाए रखने के लिए, ओस्टियोब्लास्ट अमीनो एसिड की निरंतर आपूर्ति की मांग करते हैं। इस मांग को पूरा करने के लिए, ओस्टियोब्लास्ट को सक्रिय रूप से अमीनो एसिड प्राप्त करना चाहिए। इसके अनुरूप, हाल के अध्ययनों से ओस्टियोब्लास्ट गतिविधि और हड्डी के गठन में अमीनो एसिड अपटेक और चयापचय के महत्व का पता चलता है 15,16,17,18,19,20।
ओस्टियोब्लास्ट तीन प्रमुख स्रोतों से सेलुलर अमीनो एसिड प्राप्त करते हैं: बाह्य वातावरण, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन क्षरण और डे नोवो एमिनो एसिड जैवसंश्लेषण। यह प्रोटोकॉल बाह्य वातावरण से अमीनो एसिड अपटेक के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करेगा। अमीनो एसिड अपटेक को मापने के लिए सबसे आम तरीके या तो रेडियोलेबल (जैसे, 3एच या 14सी) या भारी आइसोटोप लेबल (जैसे, 13सी) एमिनो एसिड पर निर्भर करते हैं। भारी आइसोटोपोमर परख अमीनो एसिड अपटेक और चयापचय का अधिक अच्छी तरह से और सुरक्षित रूप से विश्लेषण कर सकते हैं, लेकिन इसे पूरा करने में कई दिन लगते हैं क्योंकि नमूने तैयार करने और व्युत्पन्न करने में एक दिन लगता है और नमूने की संख्या21,22 के आधार पर मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण करने में कई दिन लगते हैं। तुलनात्मक रूप से, रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक परख डाउनस्ट्रीम चयापचय के बारे में जानकारीपूर्ण नहीं हैं, लेकिन सस्ते और अपेक्षाकृत तेज हैं, जो प्रयोग 23,24 की शुरुआत से2-3 घंटे के भीतर पूरा करने में सक्षम हैं। यहां, हम एक आसानी से परिवर्तनीय बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो विट्रो या व्यक्तिगत हड्डी शाफ्ट में सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों में रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इन दो प्रोटोकॉल के आवेदन को अन्य रेडियोलेबल अमीनो एसिड और अन्य हड्डी से जुड़े सेल प्रकारों और ऊतकों तक बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रयोगात्मक क्रमपरिवर्तनों के जवाब में अमीनो एसिड अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए एक तेज़ और संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान करता है या तो इन विट्रो या एक्स विवो। व्य?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कार्नेर प्रयोगशाला को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान आर 01 अनुदान (एआर076325 और एआर071967) द्वारा सीएमके को समर्थित किया गया है।
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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