Summary
הצמדת הראש הבסיסי של צמח הפלפל השחור היא שיטה קצרה וחסכונית בזמן כדי לפגוע בו. כאן סיפקנו שלבים מפורטים עם סרטון להדבקת צמחי פלפל שחור.
Abstract
פייפר ניגרום ל. (פלפל שחור) הוא גפן עצית טיפוסית שהיא גידול תבלינים חשוב מבחינה כלכלית ברחבי העולם. ייצור הפלפל השחור מושפע באופן משמעותי ממחלת ריקבון השורשים הנגרמת על ידי Phytophthora capsici, אשר השפיעה קשות על התפתחות התעשייה כבעיית "נקודת חנק". עם זאת, המנגנון הגנטי המולקולרי של עמידות בפלפל שחור אינו ברור, מה שמוביל להתקדמות איטית בפיתוח זנים חדשים של פלפל שחור. חיסון יעיל ומערכת דגימה מדויקת עבור Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור חיוניים לחקר האינטראקציה הזו בין צמחים לפתוגנים. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים מתודולוגיה מפורטת שבה הראש הבסיסי של פלפל שחור מחוסן עם Phytophthora capsici, תוך מתן התייחסות גם לחיסון של צמחי גפן עציים. הראש הבסיסי של צמח הפלפל השחור ננעץ כדי לפגוע בו, וכדורי תפטיר כיסו את שלושת החורים כדי לשמור על הלחות כדי שהפתוגן יוכל להדביק את הצמח היטב. שיטה זו מספקת דרך טובה יותר לפתור את חוסר היציבות הנגרם על ידי שיטות חיסון מסורתיות כולל סחף אדמה או טבילת שורשים. הוא גם מספק אמצעי מבטיח לחקר אופן הפעולה בין צמחים לבין פתוגנים צמחיים אחרים הנישאים בקרקע בגידול חקלאי מדויק.
Introduction
פלפל שחור (Piper nigrum L.) הוא מטפס עצי ואחד מגידולי התבלינים החשובים ביותר. הוא ידוע בשם "מלך התבלינים"1 והוא מעובד ביותר מ -40 מדינות ואזורים ברחבי אסיה, אפריקה ואמריקה הלטינית. ריקבון שורש פיטופתורה הוא המחלה ההרסנית ביותר של פלפל שחור, והוא נגרם על ידי oomycete Phytophthora capsici. פתוגן זה מדביק גם קוקורביטים, חצילים, פלפלי צ'ילי ועגבניות 2,3. עם פלפל שחור, יבול שלם יכול לפעמים להיות מרוסק על ידי מחלה זו. התרחבות אזורי שתילת הפלפלים מוגבלת כתוצאה מחוסר זמינותם של זנים עמידים, מה שעיכב משמעותית את התפתחות תעשיית הפלפל השחור הסינית. חיסון יעיל ומערכת דגימה מדויקת של Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור חיוניים לחקר האינטראקציה בין צמחים לפתוגנים.
זיהוי וסינון של עמידות במשאבי נבט הוא הדרישה הבסיסית לחקר הפתוגניות של הפתוגן וגידול וניצול של זנים עמידים. גישה נפוצה היא שימוש במגוון שיטות זיהוי המבוססות על מיני צמחים וקבוצות פתוגנים. שיטות הזיהוי הנוכחיות כוללות זיהוי אוכלוסייה, זיהוי אישי, זיהוי איברים, זיהוי רקמות, זיהוי תאים, זיהוי ביוכימי וזיהוי מולקולרי, אשר פותחו בשנים האחרונות 4,5. הייתה הצלחה בתחומים אלה, אך יש גם בעיות רבות. לא משנה באיזו שיטה נבחרה, הדרישות הבסיסיות של זיהוי עמידות הצמחים הן עקביות, כולל מטרות ברורות, תוצאות אמינות ושיטות פשוטות, מהירות וקלות לסטנדרטיזציה. עיקרון זה חייב להתבצע גם בזיהוי עמידות פלפל שחור.
בתנאי שדה טבעיים, זיהוי עמידות למחלות יכול להיות מושפע מגורמים סביבתיים רבים. לכן, הוצע כי עלים מנותקים ושורשים מושקים ישמשו במעבדה כדי לזהות עמידות למחלות. עלים צעירים מצמחים בריאים חוסנו במבחנה במעבדה, ואזור העלים החולים נמדד על ידי חיסון הפתוגן על מנת לזהות את עמידותם למחלות של צמחים6. עם זאת, חיסון עלים במבחנה יכול לשמש רק לזיהוי התנגדות כללית ולא למחקרי אינטראקציה מולקולרית. למרות זאת, הסטטוס העמיד למחלה מופיע לעתים קרובות בחיסון השורש המושקה, וגורם לאי-ודאות במחקר המעקב אחר גידול מולקולרי לעמידות למחלות. לכן, שיטות זיהוי מהירות ופשוטות בתוך הבית הן חיוניות. מחקר זה נועד לספק שיטה לזיהוי עמידות במעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צמחי חיתוך פלפל שחור לזיהום
- יש לבצע חיתוך של חמישה צמתים, באורך של כ-40 ס"מ בקוטר של 0.5 ס"מ, מענף אורתוטרופי בריא וצומח במרץ של פלפל שחור באמצעות סכין גיזום מחוטאת או פרשיות. גוזמים את שלושת הצמתים התחתונים של הענפים הפלגיוטרופיים, כאשר שני הצמתים העליונים נותרו עם כ-10 עלים שלמים.
- הכינו מצע השתרשות המכיל אדמה וזבל בעלי חיים (גללי פרות או גללי כבשים) ביחס של 1:1. Autoclaveed את מצע ההשתרשות ב 121 °C (66 °F) למשך 20 דקות.
- הכנס את החיתוכים למצע ההשתרשות בזווית של כ-50°, כאשר הצומת השלישי רק נוגע במשטח המצע ובניצן בית השחי בצומת זה מעל המצע.
הערה: התיק המשמש כאן הוא בעל המידות הבאות: גובה של 40-60 ס"מ, קוטר של 25-30 ס"מ. - יוצקים 10-20 ליטר מים על שורשי הצמח. מקם את החיתוכים בחממה עם 90% צל בטמפרטורה של 25-30 מעלות צלזיוס להשתרשות וצמיחה.
2. התפשטות של פיטופתורה קפסיקי (P. capsici)
הערה: מלאי של תרבית Phytophthora capsici נשמר במעבדה להגנת הצומח של המכון לחקר התבלינים והמשקאות, האקדמיה הסינית למדעי החקלאות הטרופית7.
- מברישים ומנקים את פקעות תפוחי האדמה תחת מי ברז זורמים ואז חותכים 200 גרם תפוחי אדמה לקוביות של 1 ס"מ3. מכניסים חלק מהקוביות לכוס המכילה 800 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) ומרתיחים במשך 20 דקות.
- סנן את המרק באמצעות גזה כפולה באמצעות סינון כוח הכבידה. הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) על ידי הוספת 20 גרם דקסטרוז ו-15 גרם אגר לתנין והגדלת הנפח עד 1 ליטר עם ddH2O. אוטוקלאב את התערובת ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקותו-8 דקות.
- יוצקים 20 מ"ל של מחשב כף היד המעוקר בצורה נוזלית לתוך צלחת פטרי עגולה בקוטר 9 ס"מ בתוך מכסה מנוע זרימת אוויר למינרי. השאירו את לוחות ה-PDA עם מכסים פתוחים בתוך מכסה המנוע של זרימת האוויר הלמינרי למשך הלילה כאמצעי למניעת עיבוי.
- השתמשו בלולאת חיסון כדי לאסוף תפטירים ממלאי Phytophthora capsici בתוך מבחנה. הניחו את האינוקולום עם הצד התפטירי במגע עם ה-PDA בצלחת פטרי.
3. זיהום של פלפל שחור
- דגירה
- זהה שטח של 5 ס"מ מעל פני המצע וקרוב לשורשים על הגבעול לצורך חיסון.
- ליבת דיסק של תפטירים בקוטר 0.5 ס"מ בקצה ההולך וגדל של תרבית הקפסולית Phytophthora על מחשב כף יד בצלחת פטרי באמצעות בור פקק.
- פגעו בגבעול באמצעות מחט מזרק ויצרו שלושה חורים בתבנית משולשת באזור החיסון שנבחר. מכסים כל חור בדיסקה תפטירית. מקם את החורים קרוב זה לזה כדי להבטיח שהאזור הפצוע מכוסה במלואו בדיסקות התפטיר.
- מכסים את הדיסקים התפטיריים בכריות כותנה מעוקרות ולחות כאמצעי למניעת ייבוש. קשרו את הפד לגבעול עם רצועת פוליאתילן כדי לשמור על מיקום הדיסקים המחוסנים.
הערה: בשעה 8 שעות לאחר החיסון, החורים המחוסנים הפכו שחורים והנגע התארך ככל שחלף הזמן. העלים הפכו צהובים ונשרו, והצמח המחוסן מת 7-10 ימים לאחר החיסון. לא התפתחו נגעים בצמחי הבקרה. רוב הגנים התבטאו באופן שונה לאחר חיסון עם Phytophthora capsici בהשוואה לקבוצת הביקורת. ניתוח היסטופתולוגי של הרקמות הנגועות הראה כי פיטופתורה קפסיצ'י התיישב בקסילם.
- דגימת החומרים הצמחיים המעניינים ומאחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בחנקן נוזלי לשימוש במחקרים הבאים.
הערה: חנקן נוזלי, שקיות פלסטיק, עטי טוש, גזירה של ענפים וחומרים אחרים הוכנו לפני הניסויים. - לאחר שהחומרים הצמחיים הספציפיים נדגמים לשימוש, ציידו באופן אוטומטי את כל החומרים הצמחיים הנותרים, את תרבית הקפסולה של Phytophthora ואת מדיום התרבית, ואת כל המכשירים וכלי המעבדה המשמשים בעבודת חיסון זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה את הסימפטומים של עלי פלפל שחור בעקבות חיסון P. capsici . איור 2 מראה את הסימפטומים של גבעולי פלפל שחור לאחר חיסון P. capsici . הפתוגן הדביק את הפלפל השחור בגזע הבסיס; תסמינים הכוללים הצהבת עלים, הופעת רטט, השחמה של קסילם והשחרת כלי דם המופיעים בהדרגה. איור 3 מראה שרוב הגנים באים לידי ביטוי באופן שונה לאחר החיסון עם Phytophthora capsici בהשוואה לקבוצת הביקורת. איור 4 הדגים כי פיטופתורה קפסיצי התיישבו בקסים על ידי ניתוח היסטופתולוגי של רקמות נגועות.
איור 1: הסימפטומים של עלי פלפל שחור בעקבות חיסון P. capsici 7. CK: קבוצת ביקורת; מחוסנים: לאחר החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הסימפטום של גבעולי פלפל שחור בעקבות חיסון P. capsici 7. מחוסנים: לאחר החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרופילי ביטוי מפורטים של הגנים בשורשי הפלפל השחור. פסי שגיאה באיורים מציינים את שגיאת התקן של רמות הביטוי משלושה שכפולים ביולוגיים. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 ו-48 בציר ה-x מתייחסים ל-8, 12, 24 ו-48 h על הבקרה ו-8, 12, 24 ו-48 שעות, בהתאמה, לאחר חיסון עם P. capsici. ציר ה-y מייצג את רמת הביטוי היחסית בהשוואה ליוביקוויטין. כל עמודה מייצגת את הערך הממוצע בתוספת SD (סטיית תקן) משלושה שכפולים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח היסטופתולוגי של רקמות נגועות. ההשוואה בין צביעת O כחול טולואידין לבדה (עמודה שמאלית) לבין כחול כותנה וכתם כפול ספרנין O (עמודה ימנית) (20X). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, ראש הבסיס ננעץ כדי לגרום נזקים ולספק מערכת חיסונים יעילה בצמח הפלפל השחור. לאחר מכן כיסו כדורי התפטיר את שלושת החורים כדי לשמור על הלחות ולאפשר לפתוגן להדביק את הצמח היטב. לאחר החיסון, העלים הפכו צהובים ונשרו והצמחים המחוסנים מתו. לא התפתחו נגעים בצמחי הבקרה. רוב הגנים התבטאו באופן שונה לאחר חיסון עם Phytophthora capsici בהשוואה לקבוצת הביקורת. מחלות פטרייתיות אחראיות להפרעות מבניות ופיזיולוגיות במספר משמעותי של גידולים, מה שמוביל לירידה בפריון ולהפסדים כלכליים עבור היצרנים שלהן. מחקרים מבניים המשתמשים בטכניקות היסטולוגיות על אופן החדירה וההתיישבות של רקמות צמחים על ידי פטריות מספקים אינדיקציה מפורטת לאינטראקציות בין הפתוגן לרקמה הצמחית. מחקרים אלה חשפו היבטים חשובים המסייעים בהבנת החד-אופן של מחלות. ניתוח היסטופתולוגי של רקמות נגועות הדגים כי פיטופתורה קפסיצי התיישבה בקסילם. שיטה זו מספקת אמצעי טוב יותר לפתרון חוסר היציבות הנגרם על ידי שיטות חיסון מסורתיות כולל סחף אדמה או טבילת שורשים. חיסון יעיל ומערכת דגימה מדויקת של Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור חיוניים לחקר האינטראקציה בין צמחים לפתוגנים. הוא גם מספק אמצעי מבטיח לחקר אופן הפעולה בין צמחים לבין פתוגנים צמחיים אחרים הנישאים בקרקע בגידול חקלאי מדויק.
יחד עם זאת, פרוטוקול זה מייצג דרך יעילה יותר לספק התייחסות לדגירה של גפן עצית. במחקרים קודמים, פתוגנים חוסנו על ידי טבילת שורשים עם מתלי נבגים בתרבית V8 בינוני9. לוקח 7 ימים עד שמתלי הנבגים מוכנים, בעוד שהשימוש במחשב כף יד לתרבית Phytophthora capsici לוקח רק 5 ימים. צלחת ה-PDA נאטמה באמצעות סרט כירורגי חדיר כאמצעי למניעת זיהום מחיידקים ופטריות אחרים. התרבויות נשמרו בטמפרטורת החדר. השיטה בה נעשה שימוש במחקר זה יכולה לחסוך יותר זמן ולהתבצע במהירות רבה יותר. פלפל שחור הוא גפן עצית עם הרבה סוכרים ופנולים10, והזאוספורים המיוצרים על ידי Phytophthora capsici מופיעים בדרך כלל בקרקעות, מה שמקשה על הדבקת גפנים של פלפל שחור ולגרום לחוסר יציבות זיהומית בשורש11. פרוטוקול זה מספק תוצאות טובות יותר, ומאפשר אינטראקציה חזקה בין צמחי גפן לבין פתוגנים הנישאים בקרקע. זיהוי התהליך הדינמי בין צמחים לפתוגנים גלוי ונוח.
שיטת שורש ההשקיה היא מהירה וחסכונית בזמן, אך בעיה נותרת לא פתורה עבור פלפל שחור. Phytophthora capsici הוא פתוגן הנישא בקרקע ובדרך כלל מדביק שורשי צמחים באמצעות ספורנגיה וזואוספורים12. בטבע, הספורנגיה מסוגלת להתפשט באמצעות גשם והשקיה. ברגע שהזואוספורים מתחברים לפני השטח של הצמח, צינורות הנבטים עלולים להתפתח במהירות ולחדור לרקמת הצמח, מה שגורם לזיהום13,14. זה יכול לגרום לאי ודאות שבחירת hyphae כמקור זיהום תהיה דומה לתרחיף הנבגים. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה מתחילה בכך שהוא מנקב את ראשו הבסיסי של צמח הפלפל השחור כדי לפגוע בו. האזור הפגוע מכוסה לאחר מכן ב-Phytophthora capsici והלחות נשמרת, מה שמבטיח שהפתוגן יכול להדביק את הצמח היטב. שיטה זו טובה יותר בפתרון חוסר היציבות הנגרם על ידי שיטות חיסון מסורתיות כולל טבילת אדמה או טבילת שורשים. זוהי גם שיטה מבטיחה לחקר אופן הפעולה בין צמחים לבין פתוגנים אחרים של צמחים הנישאים בקרקע בגידול חקלאי מדויק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2020YFD1001200), מערכת המחקר החקלאית של סין (CARS-11), קרן המחקר הספציפית של פלטפורמת החדשנות לאקדמאים של מחוז האינאן (YSPTZX202154), הקרן למדעי הטבע של מחוז האינאן בסין (321RC652), והקרן למדעי הטבע של סין (מס '31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
