Kombinierte mechanische und enzymatische Dissoziation von Hippocampusgewebe des Gehirns der Maus

Summary

Dieses neuronale Zelldissoziationsprotokoll ist für Proben mit einer geringen Menge an Ausgangsmaterial vorgesehen und liefert eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse mit optionalen Fixations- und Färbeschritten.

Abstract

Dieses neuronale Dissoziationsprotokoll (eine Anpassung des Protokolls, das ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene begleitet) optimiert die Gewebeverarbeitung in Vorbereitung auf detaillierte nachgelagerte Analysen wie Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierung. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination davon durchgeführt werden. Die heikle Natur neuronaler Zellen kann die Bemühungen erschweren, die hochgradig lebensfähige, echte Einzelzellsuspension mit minimalen Zelltrümmern zu erhalten, die für die Einzelzellanalyse erforderlich ist. Die Daten zeigen, dass diese Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss durchweg zu einer hochgradig lebensfähigen (>90%) Einzelzellsuspension führt, die die oben genannten Schwierigkeiten überwindet. Während einige der Schritte manuelle Geschicklichkeit erfordern, verringern diese Schritte die Probenhandhabung und den potenziellen Zellverlust. Dieses Manuskript beschreibt jeden Schritt des Prozesses, um andere Labors in die Lage zu versetzen, kleine Mengen neuronalen Gewebes in Vorbereitung auf die nachgelagerte Analyse erfolgreich zu dissoziieren.

Introduction

Der Hippocampus wurde erstmals von einem bolognesischen Anatomen, Giulio Cesare Aranzio, in den 1500er Jahren beschrieben¹. Bei der Benennung dieser neu entdeckten Struktur wurde Aranzio wahrscheinlich von seiner unheimlichen Ähnlichkeit mit dem Seepferdchen der Gattung Hippocampus¹ inspiriert. Der Hippocampus ist an Stressreaktionen beteiligt, ist aber weithin für seine Rolle beim Lernen und Gedächtnis bekannt. Genauer gesagt ist der Hippocampus für die Kodierung und den Abruf des deklarativen und räumlichen Gedächtnisses^{verantwortlich 1}.

Der Hippocampus oder Hippocampus selbst ist in die^Unterfelder CA1 (Cornu Ammonis), CA2 und CA3 1 unterteilt. Im Vergleich zum Rest des Nervensystems weist der Hippocampus mehrere einzigartige definierende Merkmale auf, darunter seine Plastizität und sein Potenzial für die laufende Neurogenese². Neurogenese ist der Prozess der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen, gefolgt von ihrer Integration in das bereits bestehende neuronale Netzwerk. Die Neurogenese ist auf die subgranulare Zone des Gyrus dentatus und die subventrikuläre Zone der lateralen Ventrikel (und der Riechkolben) ^beschränkt3. Während die Neurogenese in der Embryogenese reichlich vorhanden ist, ist es ein lebenslanger Prozess ^3,4. Daher wird sich diese Diskussion auf die adulte Neurogenese im Hippocampus konzentrieren.

Die subventrikulären und subgranularen Zonen sind neurogene Nischen, die ependymale und vaskuläre Zellen sowie unreife und reife Linien neuronaler Stammzellen enthalten⁵. Mikroglia tragen als Immunzellen zu diesen Nischen bei, um die Neurogenese zu regulieren⁶. Neurale Vorläuferzellen sind Nichtstammzell-Nachkommen von neuralen Stammzellen⁷. Drei Arten von neuronalen Vorläufern sind in der subventrikulären Zone vorhanden: radiale gliaartige Typ-B-Zellen, Typ-C-transitverstärkende Vorläufer und Typ-A-Neuroblasten ^3,8. Die sich langsam teilenden neuralen Vorläuferzellen vom Typ B in der subventrikulären Zone können sich in sich schnell teilende Typ-C-Zellen⁸ differenzieren. Anschließend differenzieren sich Typ-C-Zellen in Typ-A-Zellen⁸. Diese Neuroblasten wandern durch den rostralen Migrationsstrom zum Riechkolben, bevor sie sich in Interneuronen oder Oligodendrozyten⁹ differenzieren. Diese Riechkolben-Interneurone sind der Schlüssel zum olfaktorischen Kurzzeitgedächtnis und zum assoziativen Lernen, während die Oligodendrozyten Axone des Corpus callosum⁹ myelinieren. Der Großteil der adulten Neurogenese findet in der subgranularen Zone des Gyrus dentatus statt, wo radiale neurale Vorläufer vom Typ 1 und nichtradialen Typ 2^{gefunden werden 3}. Die meisten neuralen Vorläuferzellen sind dazu bestimmt, zu dentalen Granulatneuronen und Astrozyten¹⁰ zu werden. Durch Gap Junctions verbunden, bilden Astrozyten Netzwerke, um Plastizität, synaptische Aktivität und neuronale Erregbarkeit^zu modulieren 5. Als primäres exzitatorisches Neuron des Gyrus dentatus liefern Körnerzellen Input vom entorhinalen Kortex in die CA3-Region¹¹.

Neuronale Stammzellpopulationen können mit Hilfe von immunmagnetischen oder immunfluoreszierenden Isolationsstrategien^{isoliert werden 12,13}. Neuralgewebe ist besonders schwer zu dissoziieren; Bemühungen, dies zu tun, führen oft zu Proben mit schlechter Zelllebensfähigkeit und / oder nicht zur Herstellung der notwendigen Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination von Techniken^{durchgeführt werden 14,15}. In einer Studie zur Bewertung neuronaler Dissoziationsmethoden wurden die Lebensfähigkeit und Qualität der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung im Vergleich zu Kombinationen von Pipettenverreibung und Verdauung mit verschiedenen Enzymen^{verglichen 15}. Die Qualität wurde basierend auf der Menge an Zellklumpen und DNA oder subzellulären Ablagerungen in der vorbereiteten Suspension¹⁵ bewertet. Suspensionen von Gliatumoren, die allein einer manuellen mechanischen Dissoziation unterzogen wurden, hatten eine signifikant geringere Zelllebensfähigkeit als Behandlungen mit Dispase oder einer Kombination aus DNase, Kollagenase und Hyaluronidase¹⁵. Volovitz et al. erkannten die Unterschiede in der Lebensfähigkeit und Qualität zwischen den verschiedenen Methoden an und betonten, dass eine unzureichende Dissoziation die Genauigkeit der nachgelagerten Analyse verringern^{kann 15}.

In einer separaten Studie verglichen die Autoren über 60 verschiedene Methoden und Kombinationen der Dissoziation von kultivierten neuronalen Zellen¹⁴. Diese Methoden umfassten acht verschiedene Variationen der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung, einen Vergleich der Inkubation mit fünf einzelnen Enzymen in drei verschiedenen Intervallen und verschiedene Kombinationen der mechanischen Dissoziation mit enzymatischer Verdauung oder die Kombination von zwei Enzymen¹⁴. Keine der mechanischen Methoden ergab eine Einzelzellsuspension¹⁴. Vier der Einzelenzymbehandlungen, zehn der enzymatischen Kombinationsbehandlungen und vier der Kombinationen von mechanischer Dissoziation mit enzymatischer Verdauung ergaben eine Einzelzellsuspension¹⁴. Enzymatischer Aufschluss mit TrypLE, gefolgt von Trypsin-EDTA, dissoziierte Proben am effektivsten¹⁴. Proben, die mit TrypLE und/oder Trypsin-EDTA behandelt wurden, neigten übrigens dazu, gallertartige Klumpen^{zu bilden 14}. Während diese Studie an kultivierten Zellen durchgeführt wurde, spricht sie für die Mängel der Pipettenverreibung oder der enzymatischen Verdauung allein.

Parallele Vergleiche von manueller und automatisierter mechanischer Dissoziation fehlen. Eine Gruppe führte jedoch Durchflusszytometrie durch, um die manuelle und halbautomatische mechanische Dissoziation ganzer Mausgehirne in Verbindung mit kommerziellen Papain- oder Trypsin-Enzymdissoziationskits^{zu vergleichen 16}. Die Verarbeitung mit dem Dissoziator ergab konsistenter lebensfähige Zellen¹⁶. Nach der Dissoziation isolierten die Autoren auch Prominin-1-Zellen, neuronale Vorläuferzellen und Mikroglia¹⁶. Für zwei der drei isolierten Zellpopulationen war die Reinheit der isolierten Zellen etwas höher, wenn Proben mit dem Dissoziator verarbeitet wurden, verglichen mit^{manuell 16}. Reiß et al. stellten fest, dass die Variabilität von Mensch zu Mensch in der Pipettiertechnik die Reproduzierbarkeit der lebensfähigen Zellpopulationsausbeute bei der Gewebedissoziation behindert¹⁶. Die Autoren folgerten, dass die automatisierte mechanische Dissoziation die Probenverarbeitung^{standardisiert 16}.

Die in diesem Manuskript beschriebene Methode der Dissoziation ist eine Kombination aus vollautomatischer mechanischer Dissoziation und enzymatischer Verdauung unter Verwendung von Lösungen, die ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene¹⁷ begleiten. Im Gegensatz zu Standardprotokollen reduziert dieses optimierte Protokoll die Probenmanipulation, ergibt eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension und ist für die Verarbeitung minimaler Mengen an Ausgangsgewebe vorgesehen.

Protocol

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UAMS genehmigt wurden. 6 Monate alte weibliche C57Bl6/J-Wildtyp-Mäuse wurden gekauft und in Gruppen (4 Mäuse pro Käfig) unter einem konstanten Hell/Dunkel-Zyklus von 12 h untergebracht. 1. Herstellung von Reagenzien Bereiten Sie eine reparierbare Lebend-/Totflecken-Lagerlösung vor. Rekonstituieren Sie die fluoreszierende Färbung mit 20 μL…

Representative Results

Die Proben wurden mit einem Durchflusszytometer in einer Kernanlage verarbeitet und die resultierenden Daten wurden mit einem Softwarepaket für die Durchflussanalyse ausgewertet. Zuvor wurden Kompensationskontrollen analysiert – der lebende / tote Fleck und die Negativkontrolle. Wenn mehrere Fluorochrome verwendet werden, sollten für jeden Antikörper Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) und Einzelfleckenkontrollen vorbereitet werden. Die Kompensation der spektralen Überlappung für die experimentellen Proben wurde…

Discussion

Mehrere Schritte in diesem neuronalen Dissoziationsprotokoll erfordern eine kompetente Technik und Geschicklichkeit – Perfusion, Überstandsaspiration und Myelinentfernung. Während des gesamten Perfusionsprozesses müssen die inneren Organe intakt bleiben (abgesehen vom Entfernen des Zwerchfells und dem Abschneiden des Herzens); Dazu gehört, die oberen Kammern des Herzens mit der Schmetterlingsnadel zu vermeiden. Während die Menge an Kochsalzlösung, die mit Heparin benötigt wird, variiert, zeigt transparente Flüssi…

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting