Indel Detection etter CRISPR/Cas9 Mutagenesis ved hjelp av høyoppløselig smelteanalyse i Mygg Aedes aegypti
Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for rask identifisering av indels indusert av CRISPR / Cas9 og valg av mutantlinjer i mygg Aedes aegypti ved hjelp av høyoppløselig smelteanalyse.
Abstract
Mygggenredigering har blitt rutine i flere laboratorier med etablering av systemer som transkripsjonsaktivatorlignende effektorkjerner (TALENer), sinkfingerkjerner (SFNer) og homing endonucleases (HEs). Mer nylig har klynget regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) teknologi tilbudt et enklere og billigere alternativ for presisjonsgenomteknikk. Etter kjernevirkning vil DNA-reparasjonsveier fikse de ødelagte DNA-endene, og ofte introdusere indels. Disse out-of-frame mutasjonene brukes deretter til å forstå genfunksjonen i målorganismene. En ulempe er imidlertid at mutante individer ikke har noen dominerende markør, noe som gjør identifisering og sporing av mutante alleler utfordrende, spesielt i skalaer som trengs for mange eksperimenter.
Høyoppløselig smelteanalyse (HRMA) er en enkel metode for å identifisere variasjoner i nukleinsyresekvenser og benytter PCR-smeltekurver for å oppdage slike variasjoner. Denne post-PCR-analysemetoden bruker fluorescerende dobbeltstrengede DNA-bindende fargestoffer med instrumentering som har temperaturramperkontrolldatafangstevne og skaleres enkelt til 96-brønns plateformater. Beskrevet her er en enkel arbeidsflyt ved hjelp av HRMA for rask deteksjon av CRISPR / Cas9-induserte indels og etablering av mutantlinjer i mygg Ae. aegypti. Kritisk kan alle trinn utføres med en liten mengde benvev og krever ikke å ofre organismen, slik at genetiske kryss eller fenotypingsanalyser kan utføres etter genotyping.
Introduction
Som vektorer av patogener som dengue1, Zika2 og chikungunya3 virus, samt malarial parasitter4, representerer mygg en betydelig folkehelsetrussel mot mennesker. For alle disse sykdommene er det et betydelig fokus på overføringsintervensjon på kontroll av myggvektorer. Studie av genene som er viktige i for eksempel tillatelse til patogener, mygg fitness, overlevelse, reproduksjon og motstand mot insektmidler er nøkkelen til å utvikle nye myggkontrollstrategier. For slike formål blir genomredigering i mygg en vanlig praksis, spesielt med utvikling av teknologier som HEs, ZFNs, TALENs og senest CRISPR med Cas9. Etableringen av genredigerte stammer innebærer vanligvis å tilbakese individer som bærer de ønskede mutasjonene i noen generasjoner for å minimere off-target og grunnlegger (flaskehals) effekter, etterfulgt av å krysse heterozygote individer for å generere homozygote eller trans-heterozygote linjer. I fravær av en dominerende markør er molekylær genotyping nødvendig i denne prosessen fordi det i mange tilfeller ikke kan oppdages klare fenotypiske egenskaper for heterozygote mutanter.
Selv om sekvensering er gullstandarden for genotypisk karakterisering, utgjør det å utføre dette over hundrevis, eller muligens tusenvis av individer, betydelige kostnader, arbeidskraft og tid som kreves for å oppnå resultater, noe som er spesielt kritisk for organismer med kort levetid som mygg. Vanlige alternativer er Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 og høyoppløselig smelteanalyse (HRMA, gjennomgått i7). Både SNA og T7E1 bruker endonucleaser som cleave bare ikke samsvarer baser. Når en mutert region av det heterozygote mutantgenomet forsterkes, blir DNA-fragmenter fra mutante og villtype alleler glødet for å gjøre uoverensstemmende dobbeltstrenget DNA (dsDNA). SNA oppdager tilstedeværelsen av uoverensstemmelser via fordøyelsen med en uoverensstemmende spesifikk endonuklease og enkel agarose gelelektroforese. Alternativt bruker HRMA de termodynamiske egenskapene til dsDNA oppdaget av dsDNA-bindende fluorescerende fargestoffer, med disassosiasjonstemperaturen til fargestoffet varierende basert på tilstedeværelse og type mutasjon. HRMA har blitt brukt til påvisning av enkeltkjernepolymorfismer (SNPer)8, mutant genotyping av sebrafisk9, mikrobiologiske applikasjoner10 og plantegenetisk forskning11, blant andre.
Dette dokumentet beskriver HRMA, en enkel metode for molekylær genotyping for mutant mygg generert av CRISPR / Cas9-teknologi. Fordelene med HRMA fremfor alternative teknikker inkluderer 1) fleksibilitet, da det har vist seg nyttig for ulike gener, et bredt spekter av indelstørrelser, samt skillet mellom forskjellige indelstørrelser og heterozygot, homozygot og trans-heterozygot differensiering12,13,14, 2) kostnad, da den er basert på ofte brukte PCR-reagenser, og 3) tidsbesparende, som det kan utføres på bare noen få timer. I tillegg bruker protokollen en liten kroppsdel (et ben) som en kilde til DNA, slik at myggen kan overleve genotypingsprosessen, slik at etablering og vedlikehold av mutantlinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Høyoppløselig smelteanalyse tilbyr en enkel og rask løsning for identifisering av indels generert av CRISPR / Cas9-teknologi i vektormyggen Ae. aegypti. Det gir fleksibilitet, noe som muliggjør genotyping av mygg mutert for et bredt spekter av gener fra flymuskel til jernmetabolisme og mer13,14. HRMA kan utføres på bare noen få timer fra prøveinnsamling til de endelige analysene. Ekstra tid er nødvendig for primer design og vil også avhenge av …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle tallene ble opprettet med Biorender.com under lisens til Texas A&M University. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 og AI115138 til Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research under Insect Vectored Disease Grant Program, og USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-prosjektet 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
