Radiosintesi di 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptofano utilizzando un protocollo One-pot, Two-step

Summary

Qui, descriviamo la radiosintesi di 1-(2-[^18F]Fluoroetil)-L-triptofano, un agente di imaging tomografico ad emissione di positroni per studiare il metabolismo del triptofano, utilizzando una strategia one-pot, in due fasi in un sistema di sintesi radiochimica con buone rese radiochimiche, alto eccesso enantiomerico e alta affidabilità.

Abstract

La via della chinurenina (KP) è una via primaria per il metabolismo del triptofano. L’evidenza suggerisce fortemente che i metaboliti del KP svolgono un ruolo vitale nella proliferazione tumorale, nell’epilessia, nelle malattie neurodegenerative e nelle malattie psichiatriche a causa dei loro effetti immunomodulatori, neuromodulatori e neurotossici. L’agente più ampiamente utilizzato per la tomografia ad emissione di positroni (PET) per la mappatura del metabolismo del triptofano, α-[^11C]metil-L-triptofano ([^11C]AMT), ha una breve emivita di 20 minuti con laboriose procedure di radiosintesi. È necessario un ciclotrone in loco per radiosintetizzare [^11C]AMT. Solo un numero limitato di centri produce [^11C]AMT per studi preclinici e indagini cliniche. Quindi, è urgentemente necessario lo sviluppo di un agente di imaging alternativo che abbia un’emivita più lunga, una cinetica in vivo favorevole ed è facile da automatizzare. L’utilità e il valore di 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano, un analogo del triptofano marcato con fluoro-18, è stato riportato in applicazioni precliniche in xenotrapianti derivati dalla linea cellulare, xenotrapianti derivati dal paziente e modelli tumorali transgenici.

Questo documento presenta un protocollo per la radiosintesi di 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano utilizzando una strategia one-pot, two-step. Utilizzando questo protocollo, il radiotracciante può essere prodotto in una resa radiochimica del 20 ± 5% (decadimento corretto al termine della sintesi, n > 20), con purezza radiochimica ed eccesso enantiomerico di oltre il 95%. Il protocollo presenta una piccola quantità di precursore con non più di 0,5 mL di solvente di reazione in ogni fase, un basso carico di 4,7,13,16,21,24-esaooxa-1,10-diazabiciclo potenzialmente tossico[8.8.8]esacosano (K222) e una fase mobile ecologicamente benigna e iniettabile per la purificazione. Il protocollo può essere facilmente configurato per produrre 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano per l’indagine clinica in un modulo disponibile in commercio.

Introduction

Nell’uomo, il triptofano è un componente essenziale della dieta quotidiana. Il triptofano viene metabolizzato principalmente attraverso la via della chinurenina (KP). Il KP è catalizzato da due enzimi limitanti la velocità, indoleamina 2, 3-diossigenasi (IDO) e triptofano 2, 3-diossigenasi (TDO). Più del 95% del triptofano viene convertito in chinurenina e nei suoi metaboliti a valle, generando in definitiva nicotinamide adenina dinucleotide, che è essenziale per la trasduzione dell’energia cellulare. Il KP è un regolatore chiave del sistema immunitario e un importante regolatore della neuroplasticità e degli effetti neurotossici1,2. Il metabolismo anormale del triptofano è implicato in vari disturbi neurologici, oncologici, psichiatrici e metabolici; pertanto, gli analoghi del triptofano radiomarcati sono stati ampiamente utilizzati nelle indagini cliniche. I due radiotraccianti di triptofano clinicamente studiati più comuni sono 11C-α-metil-L-triptofano ([^11C]AMT) e ^{11C-5-idrossitriptofano} (^11C-5-HTP)3.

Nel 1990, 11C-5-HTP è stato utilizzato per visualizzare i tumori neuroendocrini secernenti ^serotonina4 e per diagnosticare e monitorare la terapia dell’adenocarcinoma prostatico refrattario all’ormone ^metastatico5. Successivamente, è stato utilizzato come strumento di imaging per la quantificazione del sistema serotoninergico nel pancreas ^endocrino6. ^{11 anni} C-5-HTP è stato anche un tracciante promettente per il rilevamento non invasivo di isole vitali nel trapianto di isole intraportali e diabete di tipo ^27,8. Negli ultimi due decenni, molti amminoacidi radiomarcati sono passati all’indagine ^clinica9,10. In particolare, l’analogo del triptofano marcato con ^{carbonio-11 [11C}]AMT ha ricevuto ampia attenzione per la mappatura della sintesi della serotonina ^{cerebrale11,12,13,14} e per la localizzazione di focolai epilettici, tumori epilettogeni, complesso di sclerosi tuberosa, gliomi e tumori al seno15,16,17,18,19,20 ^,21,22,23,24,25,26. [^11C] L’AMT ha anche un elevato assorbimento in vari tumori di basso e alto grado nei ^bambini27. Inoltre, l’analisi cinetica del tracciante di [^11C]AMT in soggetti umani è stata utilizzata per differenziare e classificare vari tumori e differenziare il glioma dal danno tissutale indotto dalle ^radiazioni15. [^11C] L’imaging guidato da AMT mostra significativi benefici clinici nei disturbi ^{cerebrali3,25}. Tuttavia, a causa della breve emivita del carbonio-11 (20 min) e delle laboriose procedure di radiosintesi, l’uso di [^11C]AMT è limitato ai pochi centri PET con un ciclotrone in loco e una struttura di radiochimica.

Fluorine-18 ha un’emivita favorevole di 109,8 min, rispetto all’emivita di 20 min del carbonio-11. Sempre più spesso, gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di radiotraccianti marcati con fluoro-18 per il metabolismo del triptofano3,28. Un totale di 15 unici radiotraccianti di triptofano con fluoro-18 sono stati riportati in termini di radioetichettatura, meccanismi di trasporto, stabilità in vitro e in vivo, biodistribuzione e assorbimento tumorale negli xenotrapianti. Tuttavia, è stata osservata una rapida defluorurazione in vivo per diversi traccianti, tra cui 4-, 5-, e 6-[^18F]fluorotriptofano, precludendo un’ulteriore traduzione ^clinica29. 5-[^18F]Fluoro-α-metiltriptofano (5-[^18F]FAMT) e 1-(2-[^18F]fluoroetil)-L-triptofano (L-[^18F]FETrp, noto anche come acido (S)-2-ammino-3-(1-(2-[^18F]fluoroetil)-1H-indol-3-il)propanoico, peso molecolare 249,28 g/mole), sono i due radiotraccianti più promettenti con cinetica in vivo favorevole nei modelli animali e grande potenziale di superamento [¹¹ C]AMT per la valutazione delle condizioni cliniche con metabolismo del triptofano ^deregolato28. 5-[^18F]FAMT ha mostrato un elevato assorbimento negli xenotrapianti tumorali IDO1-positivi di topi immunocompromessi ed è più specifico per l’imaging del KP rispetto a [^11C]AMT28,30. Tuttavia, la stabilità in vivo di 5-[^18F]FAMT rimane una potenziale preoccupazione in quanto non sono stati riportati dati di defluorurazione in vivo oltre 30 minuti dopo l’iniezione del tracer30.

Uno studio preclinico in un modello murino di medulloblastoma geneticamente modificato ha mostrato che, rispetto al 18F-fluorodesossiglucosio (^18F-FDG), L-[^18F]FETrp aveva un elevato accumulo nei tumori cerebrali, una defluorizzazione in vivo trascurabile e un basso assorbimento di fondo, dimostrando un rapporto target-non target ^{superiore31,32}. Gli studi di dosimetria delle radiazioni nei topi hanno indicato che L-[^18F]FETrp aveva un’esposizione dosimetrica favorevole inferiore di circa il 20% rispetto al tracciante clinico ^{18F-FDG PET33}. In accordo con le scoperte di altri ricercatori, i dati degli studi preclinici forniscono prove sostanziali a sostegno della traduzione clinica di L-[^18F]FETrp per lo studio del metabolismo anormale del triptofano negli esseri umani con disturbi cerebrali come epilessia, neuro-oncologia, autismo e sclerosi tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . Un confronto complessivo tra i tre traccianti più ampiamente studiati per il metabolismo del triptofano, 11C-5-HTP, [^11C]AMT e L-[^18F]FETrp, è mostrato nella Tabella 1. Sia 11C-5-HTP e [^11C]AMT hanno una breve emivita e laboriose procedure di radioelabazione. Un protocollo per la radiosintesi di L-[^18F]FETrp utilizzando un approccio one-pot, two-step è descritto qui. Il protocollo prevede l’uso di una piccola quantità di precursore di radioetichettatura, un piccolo volume di solventi di reazione, un basso carico di K222 tossico e una fase mobile ecologicamente benigna e iniettabile per la purificazione e la facile formulazione.

Protocol

ATTENZIONE: Il protocollo coinvolge materiali radioattivi. Qualsiasi dose aggiuntiva di materiali radioattivi potrebbe portare ad un aumento proporzionale della possibilità di effetti avversi sulla salute come il cancro. I ricercatori devono seguire le pratiche di dose “il più basso ragionevolmente ottenibile” (ALARA) per guidare il protocollo di radiosintesi con un’adeguata protezione nella cella calda o nel cappuccio di piombo. Ridurre al minimo il tempo di contatto diretto, utilizzare uno scudo di piombo e mantenere…

Representative Results

Lo schema di reazione è mostrato nella Figura 1. La radioetichettatura comprende le seguenti due fasi: 1) la reazione del precursore della radioetichettatura tosilato con il fluoruro [18F] fornisce l’intermedio marcato 18F e 2) la deprotezione dei gruppi terz-butilossicarbonile e terz-butil-protettivo nell’intermedio offre il prodotto finale L-[18F]FETrp. Entrambe le fasi di reazione continuano a 100 °C per 10 minuti. <p class="jove_co…

Discussion

Il triptofano è un aminoacido essenziale per l’uomo. Svolge un ruolo importante nella regolazione dell’umore, della funzione cognitiva e del comportamento. I derivati del triptofano radiomarcati, in particolare il carbon-11-labeled [^11C]AMT, sono stati ampiamente studiati grazie al loro ruolo unico nella mappatura della sintesi della ^{serotonina38,39}, nel rilevamento e nella classificazione dei ^tumori40, nella guida della chirur…

Materials

[18F]Fluoride in [18O]H2O	PETNET Solutions Inc.	N/A
4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane	ACROS	291950010	Kryptofix 222 or K222, 98%
Acetic acid	ACROS	222142500	99.8%
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004	anhydrous, 99.8%
Agilent 1260 HPLC system	Agilent Technologies	Agilent 1260	Agilent 1260 series
Analytcial chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12024AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm
Carbon dioxide, 60 LBS	Airgas	REFR744R200S	99.99%
D-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Empty sterile vial	Jubilant HollisterStier	7515	20 mm closure, 10 mL
Ethanol	Decon Labs	2716	200 proof, USP grade. ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile	Fisher Scientific	09-720-3
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721	≥37%
Isopropanol	Decon Labs	8316	70%, sterile
L-[18F]FETrp radiolabeling precursor	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
L-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Light C8 cartridge	Waters	WAT036770	Sep-Pak  C8 plus light cartridge
Needle, 20 G x 1	Becton-Dickinson & Co.	305175
Needle, 20 G x 1 ½	Becton-Dickinson & Co.	305176
Needle, 21 G x 2	Becton-Dickinson & Co.	305129
Neutral aluminum oxide	Waters	WAT023561	Sep-Pak alumina N plus light
Nylon membrane (0.20 µm )	MilliPore	GNWP04700	47 mm
Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter	Pall Corporation	4907
PETCHEM radiochemistry synthesis system	PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI	N/A	Radiosynthesizer
pH strips 2.0 – 9.0	EMD Millipore	1.09584.0001
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	367877	99.995%
Quaternary methylammonium light cartridge	Waters	186004051	Sep-Pak QMA light
Semi-preparative C18 HPLC column	Phenomenex	00D-4253-N0	100 × 10 mm
Semi-preparative chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12034AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
Sodium chloride injection 23.4%	APP Pharmaceutical, LLC	18730	USP grade
Sodium chloridei injection 0.9%	Hospira	NDC 0409-4888-10	USP grade
Sodium hydroxide	Honeywell	306576	99.99%
Spinal needle, 20 G x 3 ½	Becton-Dickinson & Co.	405182
Sterile alcohol prep pads	BioMed Resource Inc.	PC661
Sterile empty vials, 2 mL	Hollister Stier	7505ZA	13 mm closure
Sterile empty vials, 30 mL	Jubilant HollisterStier	7520ZA	20 mm closure
Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock	Air-Tite	4020-X00V0
Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock	Becton-Dickinson & Co.	309646
Syringe,  PP/PE, 10 mL, NORM-JECT	Air-Tite	4100-000V0
Syringe, 1 mL, Luer Slip	Becton-Dickinson & Co.	309659
Syringe, 3 mL, Luer-Lock	Becton-Dickinson & Co.	309657
Ultra high purity argon	Airgas	AR UHP300	99.999%
Ultrapure water	MilliporeSigma	ZRQSVP300	Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system