Summary

Radiosyntese af 1-(2-[18F]Fluorethyle)-L-Tryptophan ved hjælp af en en-pot, to-trins protokol

Published: September 21, 2021
doi:

Summary

Her beskriver vi radiosyntesen af 1-(2-[18F]Fluorethyle)-L-tryptophan, et positronemissionstomografibilleddannelsesmiddel til undersøgelse af tryptofanmetabolisme ved hjælp af en en-pot, to-trins strategi i et radiokemisk syntesesystem med gode radiokemiske udbytter, højt enantiomerisk overskud og høj pålidelighed.

Abstract

Kynureninvejen (KP) er en primær vej til tryptofanmetabolisme. Beviser tyder stærkt på, at metabolitter af KP spiller en afgørende rolle i tumorproliferation, epilepsi, neurodegenerative sygdomme og psykiatriske sygdomme på grund af deres immunmodulerende, neuromodulatoriske og neurotoksiske virkninger. Det mest udbredte positronemissionstomografi (PET) middel til kortlægning af tryptofanmetabolisme, α-[11C]methyl-L-tryptophan ([11C]AMT), har en kort halveringstid på 20 minutter med besværlige radiosynteseprocedurer. En cyklotron på stedet er påkrævet for at radiosyntetisere [11C]AMT. Kun et begrænset antal centre producerer [11C]AMT til prækliniske undersøgelser og kliniske afprøvninger. Derfor er udviklingen af et alternativt billeddannelsesmiddel, der har en længere halveringstid, gunstig in vivo-kinetik og er let at automatisere, presserende nødvendig. Nytten og værdien af 1-(2-[18F]fluorethyle)-L-tryptophan, en fluor-18-mærket tryptofananalog, er blevet rapporteret i prækliniske anvendelser i cellelinjeafledte xenografts, patientafledte xenografter og transgene tumormodeller.

Dette papir præsenterer en protokol til radiosyntese af 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-tryptophan ved hjælp af en en-pot, to-trins strategi. Ved hjælp af denne protokol kan radiotraceren produceres i et 20 ± 5% (henfald korrigeret ved syntesens afslutning, n > 20) radiokemisk udbytte med både radiokemisk renhed og enantiomert overskud på over 95%. Protokollen indeholder en lille prækursormængde med højst 0,5 ml reaktionsopløsningsmiddel i hvert trin, lav belastning af potentielt giftig 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan (K222) og en miljøvenlig og injicerbar mobil fase til rensning. Protokollen kan let konfigureres til at producere 1-(2-[18F]fluorethyle)-L-tryptophan til klinisk afprøvning i et kommercielt tilgængeligt modul.

Introduction

Hos mennesker er tryptofan en væsentlig bestanddel af den daglige kost. Tryptofan metaboliseres primært via kynureninvejen (KP). KP katalyseres af to hastighedsbegrænsende enzymer, indoleamin 2, 3-dioxygenase (IDO) og tryptophan 2, 3-dioxygenase (TDO). Mere end 95% af tryptofan omdannes til kynurenin og dets nedstrøms metabolitter, hvilket i sidste ende genererer nikotinamid adenin dinukleotid, hvilket er afgørende for cellulær energitransduktion. KP er en vigtig regulator af immunsystemet og en vigtig regulator af neuroplasticitet og neurotoksiske virkninger1,2. Unormal tryptofanmetabolisme er impliceret i forskellige neurologiske, onkologiske, psykiatriske og metaboliske lidelser; derfor er radioaktivt mærkede tryptofananaloger blevet anvendt i vid udstrækning i klinisk afprøvning. De to mest almindelige klinisk undersøgte tryptophan radiotracere er 11C-α-methyl-L-tryptophan ([11C]AMT) og 11C-5-hydroxytryptophan (11C-5-HTP)3.

I 1990’erne, 11C-5-HTP blev brugt til at visualisere serotonin-udskillende neuroendokrine tumorer4 og til at diagnosticere og overvåge terapi af metastatisk hormon-ildfast prostata adenocarcinom5. Senere blev det brugt som et billeddannelsesværktøj til kvantificering af det serotonerge system i den endokrine bugspytkirtel6. 11 C-5-HTP har også været et lovende sporstof til ikke-invasiv påvisning af levedygtige øer i intraportal ø-transplantation og type 2-diabetes7,8. I løbet af de sidste to årtier er mange radioaktivt mærkede aminosyrer avanceret til klinisk afprøvning9,10. Især har den kulstof-11-mærkede tryptofananalog [11C]AMT fået omfattende opmærksomhed for kortlægning af hjernens serotoninsyntese11,12,13,14 og for lokalisering af epileptiske foci, epileptogene tumorer, tuberøs sklerosekompleks, gliomer og brystkræft15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26. [11C] AMT har også høj optagelse i forskellige lav- og højkvalitetstumorer hos børn27. Desuden er kinetisk sporstofanalyse af [11C]AMT hos mennesker blevet anvendt til at differentiere og klassificere forskellige tumorer og differentiere gliom fra strålingsinduceret vævsskade15. [11C] AMT-guidet billeddannelse viser betydelige kliniske fordele ved hjernesygdomme3,25. På grund af den korte halveringstid for kulstof-11 (20 min) og de besværlige radiosynteseprocedurer er [11C] AMT-brug imidlertid begrænset til de få PET-centre med en cyklotron på stedet og en radiokemisk facilitet.

Fluor-18 har en gunstig halveringstid på 109,8 min sammenlignet med 20 min halveringstiden for kulstof-11. I stigende grad har indsatsen været fokuseret på udvikling af fluor-18-mærkede radiotracere til tryptofanmetabolisme3,28. I alt 15 unikke fluor-18 radioaktivt mærkede tryptophan radioracere er blevet rapporteret med hensyn til radiomærkning, transportmekanismer, in vitro og in vivo stabilitet, biodistribution og tumoroptagelse i xenografts. Der blev imidlertid observeret hurtig in vivo-defluorination for flere sporstoffer, herunder 4-, 5- og 6-[18F]fluortryptofan, hvilket udelukker yderligere klinisk translation29. 5-[18F]Fluor-α-methyltryptophan (5-[18F]FAMT) og 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-tryptophan (L-[18F]FETrp, også kendt som (S)-2-amino-3-(1-(2-[18F]fluoroethyl)-1H-indol-3-yl)propansyre, molekylvægt 249,28 g/mol), er de to mest lovende radiotracere med gunstig in vivo-kinetik i dyremodeller og stort potentiale til at overgå [11 C]AMT til evaluering af kliniske tilstande med dereguleret tryptofanmetabolisme28. 5-[18F]FAMT viste høj optagelse i IDO1-positive tumor xenografts af immunkompromitterede mus og er mere specifik for billeddannelse af KP end [11C] AMT28,30. In vivo-stabiliteten af 5-[18F]FAMT er dog fortsat et potentielt problem, da der ikke er rapporteret in vivo-defluorinationsdata ud over 30 minutter efter injektion af sporstoffet30.

En præklinisk undersøgelse i en genetisk manipuleret medulloblastommusmodel viste, at L-[18F]FETrp sammenlignet med 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) havde høj akkumulering i hjernetumorer, ubetydelig in vivo-defluornation og lav baggrundsoptagelse, hvilket viste et overlegen mål-til-ikke-mål-forhold31,32. Strålingsdosimetriundersøgelser hos mus viste, at L-[18F]FETrp havde en ca. 20% lavere gunstig dosimetrieksponering end det kliniske 18F-FDG PET-sporstof33. I overensstemmelse med andre forskeres resultater giver prækliniske undersøgelsesdata væsentlige beviser til støtte for den kliniske oversættelse af L-[18F]FETrp til undersøgelse af unormal tryptofanmetabolisme hos mennesker med hjernesygdomme som epilepsi, neuro-onkologi, autisme og tuberøs sklerose28,31,32,33,34,35,36 . En samlet sammenligning mellem de tre mest undersøgte sporstoffer til tryptofanmetabolisme, 11C-5-HTP, [11C]AMT og L-[18F]FETrp, er vist i tabel 1. Både 11C-5-HTP og [11C]AMT har en kort halveringstid og besværlige radiomærkningsprocedurer. En protokol til radiosyntese af L-[18F]FETrp ved hjælp af en en-pot, to-trins tilgang er beskrevet her. Protokollen indeholder anvendelse af en lille mængde radioaktivt mærkningsprækursor, et lille volumen reaktionsopløsningsmidler, lav belastning af giftig K222 og en miljøvenlig og injicerbar mobil fase til rensning og nem formulering.

Protocol

FORSIGTIG: Protokollen involverer radioaktive materialer. Enhver yderligere dosis af radioaktive materialer kan føre til en forholdsmæssig stigning i risikoen for sundhedsskadelige virkninger såsom kræft. Forskere skal følge alara-dosispraksis (så lavt som rimeligt opnåeligt” (ALARA) for at styre radiosynteseprotokollen med tilstrækkelig beskyttelse i den varme celle eller blyhætten. Minimering af direkte kontakttid, brug af et blyskjold og holde maksimal afstand for ethvert strålingseksponeringstrin i radiosyn…

Representative Results

Reaktionsskemaet er vist i figur 1. Radioaktiv mærkning omfatter følgende to trin: 1) reaktion af tosylatradiomærkningsprækursoren med [18F]fluorid tilvejebringer det 18F-mærkede mellemprodukt, og 2) debeskyttelse af tert-butyloxycarbonyl- og tert-butylbeskyttende grupper i mellemproduktet giver slutproduktet L-[18F]FETrp. Begge reaktionstrin fortsætter ved 100 °C i 10 minutter. Før du modtager [18F</…

Discussion

Tryptofan er en essentiel aminosyre for mennesker. Det spiller en vigtig rolle i reguleringen af humør, kognitiv funktion og adfærd. Radioaktivt mærkede tryptofanderivater, især de kulstof-11-mærkede [11C]AMT, er blevet grundigt undersøgt på grund af deres unikke rolle i kortlægningen af serotoninsyntese38,39, påvisning og klassificering af tumorer40, vejledning af epilepsikirurgi41,42

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Diagnostic & Research PET/MRI Center og af Afdelingerne for Biomedicinsk Forskning og Radiologi på Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Børn.

Materials

[18F]Fluoride in [18O]H2O PETNET Solutions Inc. N/A
4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane ACROS 291950010 Kryptofix 222 or K222, 98%
Acetic acid ACROS 222142500 99.8%
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 anhydrous, 99.8%
Agilent 1260 HPLC system Agilent Technologies Agilent 1260 Agilent 1260 series
Analytcial chiral HPLC column Sigma-Aldrich 12024AST Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm
Carbon dioxide, 60 LBS Airgas REFR744R200S 99.99%
D-FETrp standard reference Affinity Research Chemicals Inc N/A Custom synthesis
Empty sterile vial Jubilant HollisterStier 7515 20 mm closure, 10 mL
Ethanol Decon Labs 2716 200 proof, USP grade. ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile Fisher Scientific 09-720-3
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 30721 ≥37%
Isopropanol Decon Labs 8316 70%, sterile
L-[18F]FETrp radiolabeling precursor Affinity Research Chemicals Inc N/A Custom synthesis
L-FETrp standard reference Affinity Research Chemicals Inc N/A Custom synthesis
Light C8 cartridge Waters WAT036770 Sep-Pak  C8 plus light cartridge
Needle, 20 G x 1 Becton-Dickinson & Co. 305175
Needle, 20 G x 1 ½ Becton-Dickinson & Co. 305176
Needle, 21 G x 2 Becton-Dickinson & Co. 305129
Neutral aluminum oxide Waters WAT023561 Sep-Pak alumina N plus light
Nylon membrane (0.20 µm ) MilliPore GNWP04700 47 mm
Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter Pall Corporation 4907
PETCHEM radiochemistry synthesis system PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI N/A Radiosynthesizer
pH strips 2.0 – 9.0 EMD Millipore 1.09584.0001
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 367877 99.995%
Quaternary methylammonium light cartridge Waters 186004051 Sep-Pak QMA light
Semi-preparative C18 HPLC column Phenomenex 00D-4253-N0 100 × 10 mm
Semi-preparative chiral HPLC column Sigma-Aldrich 12034AST Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
Sodium chloride injection 23.4% APP Pharmaceutical, LLC 18730 USP grade
Sodium chloridei injection 0.9% Hospira NDC 0409-4888-10 USP grade
Sodium hydroxide Honeywell 306576 99.99%
Spinal needle, 20 G x 3 ½ Becton-Dickinson & Co. 405182
Sterile alcohol prep pads BioMed Resource Inc. PC661
Sterile empty vials, 2 mL Hollister Stier 7505ZA 13 mm closure
Sterile empty vials, 30 mL Jubilant HollisterStier 7520ZA 20 mm closure
Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock Air-Tite 4020-X00V0
Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock Becton-Dickinson & Co. 309646
Syringe,  PP/PE, 10 mL, NORM-JECT Air-Tite 4100-000V0
Syringe, 1 mL, Luer Slip Becton-Dickinson & Co. 309659
Syringe, 3 mL, Luer-Lock Becton-Dickinson & Co. 309657
Ultra high purity argon Airgas AR UHP300 99.999%
Ultrapure water MilliporeSigma ZRQSVP300 Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system

References

  1. Cetina Biefer, H. R., Vasudevan, A., Elkhal, A. Aspects of tryptophan and nicotinamide adenine dinucleotide in immunity: A new twist in an old tale. International Journal of Tryptophan Research. 10, 1178646917713491 (2017).
  2. Savitz, J. The kynurenine pathway: a finger in every pie. Molecular Psychiatry. 25 (1), 131-147 (2020).
  3. Zlatopolskiy, B. D., et al. 11C- and 18F-labelled tryptophans as PET-tracers for imaging of altered tryptophan metabolism in age-associated disorders. Russian Chemical Reviews. 89 (9), 879-896 (2020).
  4. Eriksson, B., et al. Positron emission tomography (PET) in neuroendocrine gastrointestinal tumors. Acta Oncologica. 32 (2), 189-196 (1993).
  5. Kälkner, K. M., et al. Positron emission tomography (PET) with 11C-5-Hydroxytryptophan (5-HTP) in patients with metastatic hormone-refractory prostatic adenocarcinoma. Nuclear Medicine and Biology. 24 (4), 319-325 (1997).
  6. Eriksson, O., et al. Quantitative imaging of serotonergic biosynthesis and degradation in the endocrine pancreas. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 460-465 (2014).
  7. Carlbom, L., et al. 11C]5-hydroxy-tryptophan pet for assessment of islet mass during progression of type 2 diabetes. Diabetes. 66 (5), 1286-1292 (2017).
  8. Eriksson, O., et al. Positron emission tomography to assess the outcome of intraportal islet transplantation. Diabetes. 65 (9), 2482-2489 (2016).
  9. Jager, P. L., et al. Radiolabeled amino acids: Basic aspects and clinical applications in oncology. Journal of Nuclear Medicine. 42 (3), 432-445 (2001).
  10. Langen, K. J., Galldiks, N. Update on amino acid pet of brain tumours. Current Opinion in Neurology. 31 (4), 354-361 (2018).
  11. Chugani, D. C., Muzik, O., Chakraborty, P., Mangner, T., Chugani, H. T. Human brain serotonin synthesis capacity measured in vivo with α-[C-11]methyl-L-tryptophan. Synapse. 28 (1), 33-43 (1998).
  12. Chugani, D. C., Muzik, O. Alpha[C-11]methyl-L-tryptophan PET maps brain serotonin synthesis and Kynurenine pathway metabolism. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 20, 2-9 (2000).
  13. Diksic, M., Nagahiro, S., Sourkes, T. L., Yamamoto, Y. L. A new method to measure brain serotonin synthesis in vivo. I. Theory and basic data for a biological model. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (1), 1-12 (1990).
  14. Diksic, M., Young, S. N. Study of the brain serotonergic system with labeled α-methyl-L-tryptophan. Journal of Neurochemistry. 78 (6), 1185-1200 (2001).
  15. Alkonyi, B., et al. Accurate differentiation of recurrent gliomas from radiation injury by kinetic analysis of α-11C-methyl-L-tryptophan PET. Journal of Nuclear Medicine. 53, 1058-1064 (2012).
  16. Bagla, S., et al. A distinct microRNA expression profile is associated with α[11C]-methyl-L-tryptophan (AMT) PET uptake in epileptogenic cortical tubers resected from patients with tuberous sclerosis complex. Neurobiology of Disease. 109, 76-87 (2018).
  17. Alkonyi, B., et al. Increased tryptophan transport in epileptogenic dysembryoplastic neuroepithelial tumors. Journal of Neuro-oncology. 107 (2), 365-372 (2012).
  18. Chugani, D. C. α-methyl-L-tryptophan: Mechanisms for tracer localization of epileptogenic brain regions. Biomarkers in Medicine. 5 (5), 567-575 (2011).
  19. Chugani, D. C., et al. Imaging epileptogenic tubers in children with tuberous sclerosis complex using α-[11C]methyl-L-tryptophan positron emission tomography. Annals of Neurology. 44 (6), 858-866 (1998).
  20. Chugani, H. T., et al. α-[11C]-Methyl-L-tryptophan-PET in 191 patients with tuberous sclerosis complex. Neurology. 81 (7), 674-680 (2013).
  21. Jeong, J. W., et al. Multi-modal imaging of tumor cellularity and tryptophan metabolism in human Gliomas. Cancer Imaging. 15 (1), 10 (2015).
  22. Juhász, C., et al. Quantitative PET imaging of tryptophan accumulation in gliomas and remote cortex. Clinical Nuclear Medicine. 37 (9), 838-842 (2012).
  23. Juhász, C., et al. Tryptophan metabolism in breast cancers: Molecular imaging and immunohistochemistry studies. Nuclear Medicine and Biology. 39 (7), 926-932 (2012).
  24. Juhász, C., et al. Successful surgical treatment of an inflammatory lesion associated with new-onset refractory status epilepticus. Neurosurgical Focus. 34, 5 (2013).
  25. Kumar, A., Asano, E., Chugani, H. T. α-[11C]-methyl-L-tryptophan PET for tracer localization of epileptogenic brain regions: Clinical studies. Biomarkers in Medicine. 5 (5), 577-584 (2011).
  26. Tiwari, V. N., Kumar, A., Chakraborty, P. K., Chugani, H. T. Can diffusion tensor imaging (DTI) identify epileptogenic tubers in tuberous sclerosis complex? Correlation with α-[11C]methyl-L-tryptophan ([11C]AMT) positron emission tomography (PET). Journal of Child Neurology. 27 (5), 598-603 (2012).
  27. Juhász, C., et al. In vivo uptake and metabolism of α-[11C]methyl-L-tryptophan in human brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (3), 345-357 (2006).
  28. John, F., Muzik, O., Mittal, S., Juhász, C. Fluorine-18-labeled PET radiotracers for imaging tryptophan uptake and metabolism: a systematic review. Molecular Imaging and Biology. 22 (4), 805-819 (2020).
  29. Zlatopolskiy, B. D., et al. Discovery of 7-[ 18 F]fluorotryptophan as a novel positron emission tomography (PET) probe for the visualization of tryptophan metabolism in vivo. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (1), 189-206 (2018).
  30. Giglio, B. C., et al. Synthesis of 5-[18F]fluoro-α-methyl tryptophan: New trp based PET agents. Theranostics. 7 (6), 1524-1530 (2017).
  31. Yue, X., et al. Comparison of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan and FDG for the detection of medulloblastoma in a transgenic mouse model. Journal of Nuclear Medicine. 60, 545 (2019).
  32. Xin, Y., et al. PET imaging of medulloblastoma with an 18F-labeled tryptophan analogue in a transgenic mouse model. Scientific Reports. 10 (1), 3800 (2020).
  33. Michelhaugh, S. K., et al. Assessment of tryptophan uptake and kinetics using 1-(2-18F-fluoroethyl)-L-tryptophan and α-11C-methyl-L-tryptophan PET imaging in mice implanted with patient-derived brain tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 58 (2), 208-213 (2017).
  34. Xin, Y., Cai, H. Improved radiosynthesis and biological evaluations of L- and D-1-[18F]fluoroethyl-tryptophan for PET imaging of IDO-mediated kynurenine pathway of tryptophan metabolism. Molecular Imaging and Biology. 19 (4), 589-598 (2017).
  35. Henrottin, J., et al. Fully automated radiosynthesis of N1-[18F]fluoroethyl-tryptophan and study of its biological activity as a new potential substrate for indoleamine 2,3-dioxygenase PET imaging. Nuclear Medicine and Biology. 43 (6), 379-389 (2016).
  36. Xin, Y., et al. Evaluation of l-1-[18F]Fluoroethyl-tryptophan for PET imaging of cancer. Molecular Imaging and Biology. 21 (6), 1138-1146 (2019).
  37. Yue, X., et al. Automated production of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan for imaging of tryptophan metabolism. Applied Radiation and Isotopes. 156, 109022 (2020).
  38. Booij, L., et al. Brain serotonin synthesis in adult males characterized by physical aggression during childhood: A 21-year longitudinal study. PLoS ONE. 5 (6), 11255 (2010).
  39. Chandana, S. R., et al. Significance of abnormalities in developmental trajectory and asymmetry of cortical serotonin synthesis in autism. International Journal of Developmental Neuroscience. 23 (2-3), 171-182 (2005).
  40. Juhász, C., Dwivedi, S., Kamson, D. O., Michelhaugh, S. K., Mittal, S. Comparison of amino acid positron emission tomographic radiotracers for molecular imaging of primary and metastatic brain tumors. Molecular Imaging. 13 (6), 1-10 (2014).
  41. Rubí, S., et al. Positron emission tomography with α-[11C]methyl-L-tryptophan in tuberous sclerosis complex-related epilepsy. Epilepsia. 54 (12), 2143-2150 (2013).
  42. Chugani, H. T., et al. Clinical and histopathologic correlates of 11C-alpha-methyl-L-tryptophan (AMT) PET abnormalities in children with intractable epilepsy. Epilepsia. 52 (9), 1692-1698 (2011).
  43. Muzik, O., Burghardt, P., Yi, Z., Kumar, A., Seyoum, B. Successful metformin treatment of insulin resistance is associated with down-regulation of the kynurenine pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 488 (1), 29-32 (2017).
  44. Sun, T., et al. Radiosynthesis of 1-[18F]fluoroethyl-L-tryptophan as a novel potential amino acid PET tracer. Applied Radiation and Isotopes. 70 (4), 676-680 (2012).
  45. Mock, B. H., Winkle, W., Vavrek, M. T. A color spot test for the detection of Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG preparations. Nuclear Medicine and Biology. 24 (2), 193-195 (1997).
  46. Kim, D. W., Jeong, H. J., Lim, S. T., Sohn, M. H. Recent trends in the nucleophilic [18F]-radiolabeling method with no-carrier-added [18F]fluoride. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 44 (1), 25-32 (2010).
check_url/fr/63025?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Yue, X., Nikam, R. M., Kecskemethy, H. H., Kandula, V. V. R., Falchek, S. J., Averill, L. W., Langhans, S. A. Radiosynthesis of 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-Tryptophan using a One-pot, Two-step Protocol. J. Vis. Exp. (175), e63025, doi:10.3791/63025 (2021).

View Video