मुरीन रेटिना में एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन, इंट्राविट्रियल इंजेक्शन, रेटिना इमेजिंग और रेटिना जीनोमिक डीएनए अलगाव के साथ डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) का उपयोग करके माउस रेटिना में एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता की मात्रा कैसे निर्धारित करता है।
Abstract
कई रेटिना सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं अब नियमित रूप से जीन संपादन और नियामक अनुप्रयोगों के लिए Adeno से जुड़े वायरस (AAVs) का उपयोग करें । एएवी ट्रांसडक्शन की दक्षता आमतौर पर महत्वपूर्ण होती है, जो समग्र प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करती है। ट्रांसडक्शन दक्षता के लिए मुख्य निर्धारकों में से एक एएवी वेक्टर का सेरोटाइप या संस्करण है। वर्तमान में, सेल सरफेस रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए विभिन्न कृत्रिम एएवी सेरोटाइप और वेरिएंट विभिन्न समानताओं के साथ उपलब्ध हैं। रेटिना जीन थेरेपी के लिए, इसके परिणामस्वरूप विभिन्न रेटिना सेल प्रकारों के लिए ट्रांसडक्शन क्षमता की अलग-अलग डिग्री होती है। इसके अलावा, इंजेक्शन मार्ग और एएवी उत्पादन की गुणवत्ता रेटिना एएवी ट्रांसडक्शन क्षमता को भी प्रभावित कर सकती है। इसलिए, विभिन्न वेरिएंट, बैचों और पद्धतियों की दक्षता की तुलना करना आवश्यक है। डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) विधि उच्च परिशुद्धता के साथ न्यूक्लिक एसिड की मात्रा को निर्धारित करती है और बिना किसी मानक या संदर्भ के किसी दिए गए लक्ष्य की पूर्ण मात्राकरण करने की अनुमति देती है। डीडी-पीसीआर का उपयोग करके, इंजेक्शन रेटिना के भीतर एएवी जीनोम कॉपी नंबरों की पूर्ण मात्राकरण द्वारा एएवी की ट्रांसडक्शन क्षमता का आकलन करना भी संभव है। यहां, हम डीडी-पीसीआर का उपयोग करके रेटिना कोशिकाओं में एएवी की ट्रांसडक्शन दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं। मामूली संशोधनों के साथ, यह पद्धति माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की कॉपी संख्या क्वांटिफिकेशन के साथ-साथ आधार संपादन की दक्षता का आकलन करने के लिए भी आधार हो सकती है, जो कई रेटिना रोगों और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
Adeno संबद्ध वायरस (AAVs) अब आमतौर पर रेटिना जीन थेरेपी अध्ययन की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है । एएवी कम इम्यूनोजेनिसिटी और कम जीनोम एकीकरण के साथ जीन वितरण का एक सुरक्षित और कुशल तरीका प्रदान करते हैं। लक्ष्य कोशिका में एएवी प्रवेश एंडोसाइटोसिस के माध्यम से होता है, जिसके लिए कोशिका की सतह1,2पर रिसेप्टर्स और सह-रिसेप्टर्स के बाध्यकारी की आवश्यकता होती है। इसलिए, विभिन्न सेल प्रकारों के लिए एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता मुख्य रूप से कैप्सिड और मेजबान सेल रिसेप्टर्स के साथ इसकी बातचीत पर निर्भर करती है। एएवी में सेरोटाइप होते हैं और प्रत्येक सेरोटाइप में अलग सेलुलर/टिश्यू ट्रॉपिज्म और ट्रांसडक्शन क्षमता हो सकती है । वायरस कैप्सिड के रासायनिक संशोधन, हाइब्रिड कैप्सिड के उत्पादन, पेप्टाइड प्रविष्टि, कैप्सिड फेरबदल, निर्देशित विकास, और तर्कसंगत म्यूटेनेसिस3के रासायनिक संशोधन द्वारा उत्पन्न कृत्रिम एएवी सेरोटाइप और वेरिएंट भी हैं। यहां तक कि अमीनो एसिड सीक्वेंस या कैप्सिड संरचना में मामूली परिवर्तनों का मेजबान कोशिका कारकों के साथ बातचीत पर प्रभाव पड़ सकता है और इसके परिणामस्वरूप विभिन्न ट्रोपिज्म4हो सकते हैं । कैप्सिड वेरिएंट के अलावा, इंजेक्शन मार्ग और एएवी उत्पादन के बैच-टू-बैच भिन्नता जैसे अन्य कारक न्यूरोनल रेटिना में एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, विभिन्न वेरिएंट के लिए ट्रांसडक्शन दरों की तुलना के लिए विश्वसनीय तरीके आवश्यक हैं।
AAV ट्रांसडक्शन दक्षता का निर्धारण करने के लिए अधिकांश तरीके रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं। इनमें फ्लोरोसेंट इमेजिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, वेस्टर्न ब्लॉट, या रिपोर्टर जीन प्रोडक्ट5,6,7का हिस्टोकेमिकलएनालिसिसशामिल है । हालांकि, AAVs के आकार की बाधा के कारण, यह हमेशा के लिए रिपोर्टर जीन शामिल करने के लिए स्थानांतरण दक्षता की निगरानी संभव नहीं है । हाइब्रिड सीएमवी एन्हांसर/चिकन बीटा-ऐक्टिन या वुडचक हेपेटाइटिस पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटरी एलिमेंटेशन एलिमेंटेशनल (डब्ल्यूपीआरई) जैसे मजबूत प्रमोटरों का इस्तेमाल एमआरएनए स्टेबलाइजर सीक्वेंस के रूप में और आकार की समस्या8को जटिल बना देता है । इसलिए, इंजेक्शन एएवी की ट्रांसडक्शन दर को अधिक प्रत्यक्ष पद्धति के साथ परिभाषित करना भी फायदेमंद होगा।
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) नमूनों की मिनट मात्रा से लक्ष्य डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। डीडी-पीसीआर तकनीक तेल की बूंदों द्वारा लक्ष्य डीएनए और पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के एनकैप्सुलेशन पर निर्भर करती है। प्रत्येक डीडी-पीसीआर प्रतिक्रिया में हजारों बूंदें होती हैं। प्रत्येक बूंद को एक स्वतंत्र पीसीआर प्रतिक्रिया के रूप में संसाधित और विश्लेषण कियाजाताहै । बूंदों का विश्लेषण केवल पॉइसन एल्गोरिदम का उपयोग करके किसी भी नमूने में लक्षित डीएनए अणुओं की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की गणना करने में सक्षम बनाता है। चूंकि एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता न्यूरोनल रेटिना में एएवी जीनोम की कॉपी संख्या के साथ सहसंबद्ध है, इसलिए हमने एएवी जीनोम की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीडी-पीसीआर विधि का उपयोग किया।
यहां, हम रेटिना जीनोमिक डीएनए6,10से एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन दक्षता की गणना करने के लिए डीडी-पीसीआर पद्धति का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, TDTomato रिपोर्टर व्यक्त करने वाले AAVs को छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, और डीडी-पीसीआर विधि11द्वारा टिटर किया गया था। दूसरे, AAVs को न्यूरोनल रेटिना में इंट्राविटली इंजेक्ट किया गया था । ट्रांसडक्शन दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पहले tdTomato अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की। इसके बाद डीडी-पीसीआर का उपयोग कर इंजेक्शन रेटिना में एएवी जीनोम की मात्रा के लिए जीनोमिक डीएनए का अलगाव किया गया । डीडी-पीसीआर द्वारा निर्धारित ट्रांसड्यूडेड एएवी जीनोम के साथ टीडीटोमाटो अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना से पता चला है कि डीडी-पीसीआर विधि ने एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन दक्षता को सटीक रूप से निर्धारित किया है। हमारे प्रोटोकॉल ने एएवी ट्रांसडक्शन क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीडी-पीसीआर आधारित कार्यप्रणाली का विस्तृत विवरण प्रदर्शित किया। इस प्रोटोकॉल में, हम एएवी जीनोम की पूर्ण संख्या भी दिखाते हैं जो जीनोमिक डीएनए अलगाव और डीडी-पीसीआर परिणामों के बाद कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके इंट्रावियल इंजेक्शन के बाद ट्रांसड्यूड किए जाते हैं। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, जो रेटिना में एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन क्षमता को निर्धारित करने के लिए रिपोर्टर अभिव्यक्ति का विकल्प होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हमने दो एएवी वैक्टर उत्पन्न किए जिनमें अलग-अलग कैप्सिड प्रोटीन होते हैं और फिर तदनुसार उन्हें टाइटर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम यह है कि पर्याप्त मात्रा में एएव…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम AAV उत्पादन के लिए उनकी मदद और समर्थन के लिए Oezkan Keles, जोसेफिन Jüttner, और प्रो Botond Roska, आणविक और नैदानिक नेत्र विज्ञान बेसल, जटिल वायरस मंच के संस्थान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम AAV8/BP2 तनाव के लिए पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के पेरेलमैन स्कूल ऑफ मेडिसिन के प्रोफेसर जीन बेनेट को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । पशु काम Gebze तकनीकी विश्वविद्यालय पशु सुविधा में किया जाता है । इसके लिए हम लेयला दीक्षित और प्रो उइगर हलीस ताजेबे को पशुपालन के लिए तकनीकी सहायता और सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणियों के लिए डॉ फातमा ओजडेमिर को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । यह काम TUBITAK, अनुदान संख्या 118C226 और 121N275, और सबांसी विश्वविद्यालय एकीकरण अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
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