طريقة ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمية القطيرات للقياس الكمي لكفاءة نقل AAV في شبكية العين مورين
Summary
يقدم هذا البروتوكول كيفية قياس كفاءة نقل AAV في شبكية العين الماوس باستخدام PCR قطرة رقمية (dd-PCR) جنبا إلى جنب مع إنتاج AAV على نطاق صغير، والحقن داخلفيتريال، والتصوير الشبكي، وعزل الحمض النووي الجينومي الشبكية.
Abstract
تستخدم العديد من مختبرات بيولوجيا خلايا الشبكية الآن الفيروسات المرتبطة بال أدينو بشكل روتيني (AAVs) لتحرير الجينات والتطبيقات التنظيمية. عادة ما تكون كفاءة نقل AAV حاسمة ، مما يؤثر على النتائج التجريبية الإجمالية. أحد المحددات الرئيسية لكفاءة النقل هو النمط المصلي أو المتغير لمتجه AAV. حاليا، مختلف الأنماط المصلية AAV الاصطناعية والمتغيرات متوفرة مع تقارب مختلفة لاستضافة مستقبلات سطح الخلية. بالنسبة للعلاج الجيني الشبكي، يؤدي ذلك إلى درجات متفاوتة من كفاءة النقل لأنواع مختلفة من خلايا الشبكية. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر مسار الحقن وجودة إنتاج AAV أيضا على كفاءة نقل AAV الشبكية. لذلك، من الضروري مقارنة كفاءة المتغيرات المختلفة، الدفعات والمنهجيات. تحدد طريقة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (dd-PCR) الرقمية الأحماض النووية بدقة عالية وتسمح بإجراء قياس كمي مطلق لهدف معين دون أي معيار أو مرجع. باستخدام DD-PCR، فمن الممكن أيضا لتقييم كفاءة النقل من AAVs عن طريق القياس الكمي المطلق للأرقام نسخة الجينوم AAV داخل شبكية العين عن طريق الحقن. هنا، نقدم طريقة مباشرة لتحديد معدل نقل AAVs في خلايا الشبكية باستخدام dd-PCR. مع تعديلات طفيفة، يمكن أن تكون هذه المنهجية أيضا الأساس لعدد نسخة القياس الكمي للحمض النووي الميتوكوندريا، فضلا عن تقييم كفاءة التحرير قاعدة، حاسمة لعدة أمراض الشبكية وتطبيقات العلاج الجيني.
Introduction
تستخدم الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAVs) الآن بشكل شائع لمجموعة متنوعة من دراسات العلاج الجيني الشبكي. توفر AAVs طريقة آمنة وفعالة لتسليم الجينات مع انخفاض المناعة وتقليل تكامل الجينوم. AAV الدخول إلى الخلية المستهدفة يحدث من خلال الغدد الصماء، الأمر الذي يتطلب ربط المستقبلات والمستقبلات المشتركة على سطح الخلية1،2. لذلك ، تعتمد كفاءة نقل AAVs لأنواع الخلايا المختلفة بشكل رئيسي على الكابسيد وتفاعلاته مع مستقبلات الخلايا المضيفة. AAVs لها أنماط مصلية ويمكن أن يكون كل نوع مصلي متميزة التروبينات الخلوية / الأنسجة وكفاءة النقل. وهناك أيضا الأنماط المصلية AAV الاصطناعية والمتغيرات الناتجة عن التعديل الكيميائي للفيروس capsid، وإنتاج capsids الهجين، إدراج الببتيد، خلط capsid، تطور موجه، و mutagenesis العقلاني3. حتى التغييرات الطفيفة في تسلسل الأحماض الأمينية أو هيكل capsid يمكن أن يكون لها تأثير على التفاعلات مع عوامل الخلية المضيفة ويؤدي إلى تروبزم مختلفة4. بالإضافة إلى المتغيرات capsid، عوامل أخرى مثل مسار الحقن والاختلاف دفعة إلى دفعة من إنتاج AAV يمكن أن تؤثر على كفاءة النقل من AAVs في شبكية العين العصبية. ولذلك، من الضروري استخدام أساليب موثوقة لمقارنة معدلات النقل لمختلف المتغيرات.
تعتمد غالبية طرق تحديد كفاءة نقل AAV على التعبير الجيني للمراسل. وتشمل هذه التصوير الفلوري، الكيمياء المناعية، لطخة الغربية، أو التحليل الهستوشيائي للمنتج الجيني مراسل5،6،7. ومع ذلك ، بسبب ضيق حجم AAVs ، فإنه ليس من الممكن دائما تضمين جينات المراسل لمراقبة كفاءة النقل. استخدام المروجين قوية مثل محسن CMV الهجين / الدجاج بيتا أكتين أو وودتشاك التهاب الكبد بعد النسخ العنصر التنظيمي (WPRE) لتسلسل مثبت مرنا يزيد من تعقيد مشكلة حجم8. لذلك، سيكون من المفيد أيضا تحديد معدل نقل مركبات AAVs المحقونة بمنهجية أكثر مباشرة.
قطرات رقمية PCR (dd-PCR) هو تقنية قوية لقياس الحمض النووي المستهدف من كميات دقيقة من العينات. تعتمد تقنية dd-PCR على تغليف خليط تفاعل الحمض النووي وPCR المستهدف بواسطة قطرات الزيت. كل رد فعل DD-PCR يحتوي على الآلاف من قطرات. تتم معالجة كل قطرة وتحليلها كرد فعل PCR مستقل9. تحليل قطرات تمكن من حساب عدد النسخ المطلق من جزيئات الحمض النووي الهدف في أي عينة ببساطة باستخدام خوارزمية بواسون. منذ ترتبط كفاءة النقل من AAVs مع عدد نسخة من الجينوم AAV في شبكية العين العصبية، استخدمنا طريقة DD-PCR لقياس الجينوم AAV.
هنا، ونحن نصف منهجية DD-PCR لحساب كفاءة نقل ناقلات AAV من الحمض النووي الجينومالشبكية 6،10. أولا، تم إنشاء AAVs التي تعبر عن مراسل tdTomato باستخدام بروتوكول نطاق صغير، و titered بواسطة DD-PCR طريقة11. ثانيا، تم حقن AAVs داخل الشبكية العصبية. لإثبات كفاءة النقل ، قمنا أولا بقياس تعبير tdTomato باستخدام المجهر الفلوري وبرامج ImageJ. وأعقب ذلك عزل الحمض النووي الجينومي للقياس الكمي لجينوم AAV في شبكية العين المحقونة باستخدام DD-PCR. وأظهرت مقارنة مستويات التعبير tdTomato مع الجينوم AAV المنقولة التي تم قياسها كميا من قبل DD-PCR أن طريقة dd-PCR بدقة كميا كفاءة النقل من ناقلات AAV. أظهرت بروتوكولاتنا وصفا مفصلا لمنهجية تستند إلى DD-PCR لقياس كفاءة نقل AAV. في هذا البروتوكول، نعرض أيضا العدد المطلق لجينوم AAV الذي يتم نقله بعد الحقن داخلفيتريال ببساطة باستخدام عامل التخفيف بعد عزل الحمض النووي الجينومي ونتائج DD-PCR. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية، والتي ستكون بديلا للتعبير عن المراسل لتحديد كفاءة النقل من ناقلات AAV في شبكية العين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، قمنا بتوليد ناقلين للطائرات بدون طيار لديهما بروتينات كابسيد مختلفة ثم قمنا بتكرارها وفقا لذلك. واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هو إنتاج كميات كافية من AAVs التي سوف تسفر عن التعبير مراسل يمكن الكشف عنها بعد النقل12،13.
<p class="jove_conte…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أويزكان كيليس وجوزفين جوتنر والبروفيسور بونتند روسكا، معهد بازل لطب العيون الجزيئي والسريري، منصة الفيروسات المعقدة لمساعدتهم ودعمهم لإنتاج AAV. كما نود أن نشكر البروفيسور جان بينيت، كلية بيرلمان للطب، جامعة بنسلفانيا على سلالة AAV8/BP2. يتم تنفيذ الأعمال الحيوانية في منشأة الحيوانات في جامعة Gebze التقنية. ولهذا نشكر ليلى ديكميتاس والبروفيسور أويغار هاليس تازباي على المساعدة التقنية والدعم تربية الحيوانات. كما نود أن نشكر الدكتورة فاطمة أوزدمير على تعليقاتها على المخطوطة. ويدعم هذا العمل من قبل TUBITAK، أرقام المنح 118C226 و 121N275، ومنحة الاندماج جامعة سابانشي.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
