Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut
Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.
Abstract
Viele Labore für netzhautzellbiologie verwenden heute routinemäßig Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für Gen-Editing und regulatorische Anwendungen. Die Effizienz der AAV-Transduktion ist in der Regel kritisch, was sich auf die gesamten experimentellen Ergebnisse auswirkt. Eine der Hauptdeterminanten für die Transduktionseffizienz ist der Serotyp oder die Variante des AAV-Vektors. Derzeit sind verschiedene künstliche AAV-Serotypen und -Varianten mit unterschiedlichen Affinitäten zu Wirtszelloberflächenrezeptoren verfügbar. Für die retinale Gentherapie führt dies zu unterschiedlichen Transduktionswirkungsgraden für verschiedene retinale Zelltypen. Darüber hinaus können der Injektionsweg und die Qualität der AAV-Produktion auch die retinale AAV-Transduktionseffizienz beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Effizienz verschiedener Varianten, Chargen und Methoden zu vergleichen. Die digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) quantifiziert die Nukleinsäuren mit hoher Präzision und ermöglicht die durchführung einer absoluten Quantifizierung eines bestimmten Ziels ohne Standard oder Referenz. Mit hilfe der dd-PCR ist es auch möglich, die Transduktionseffizienzen von AAVs durch absolute Quantifizierung der AAV-Genomkopienzahlen innerhalb einer injizierten Netzhaut zu bewerten. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Quantifizierung der Transduktionsrate von AAVs in Netzhautzellen mittels dd-PCR zur Verfügung. Mit geringfügigen Modifikationen kann diese Methodik auch die Grundlage für die Kopienzahlquantifizierung der mitochondrialen DNA sowie für die Bewertung der Effizienz der Basenbearbeitung sein, die für mehrere Netzhauterkrankungen und Gentherapieanwendungen von entscheidender Bedeutung ist.
Introduction
Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden heute häufig für eine Vielzahl von retinalen Gentherapiestudien verwendet. AAVs bieten eine sichere und effiziente Art der Genabgabe mit weniger Immunogenität und weniger Genomintegrationen. Der AAV-Eintritt in die Zielzelle erfolgt durch Endozytose, die eine Bindung von Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erfordert1,2. Daher hängt die Transduktionseffizienz von AAVs für verschiedene Zelltypen hauptsächlich vom Kapsid und seinen Wechselwirkungen mit den Wirtszellrezeptoren ab. AAVs haben Serotypen und jeder Serotyp kann unterschiedliche Zell- / Gewebetropismen und Transduktionseffizienzen aufweisen. Es gibt auch künstliche AAV-Serotypen und -Varianten, die durch chemische Modifikation des Viruskapsids, Produktion von Hybridkasiden, Peptidinsertion, Kapsidmuffling, gerichtete Evolution und rationale Mutagenese erzeugt werden3. Selbst geringfügige Veränderungen der Aminosäuresequenz oder der Kapsidstruktur können einen Einfluss auf Wechselwirkungen mit Wirtszellfaktoren haben und zu unterschiedlichen Tropismen führen4. Neben Kapsidvarianten können andere Faktoren wie der Injektionsweg und die Batch-to-Batch-Variation der AAV-Produktion die Transduktionseffizienz von AAVs in der neuronalen Netzhaut beeinflussen. Daher sind zuverlässige Methoden für den Vergleich von Transduktionsraten für verschiedene Varianten notwendig.
Die Mehrheit der Methoden zur Bestimmung der AAV-Transduktionseffizienz beruht auf der Expression des Reportergens. Dazu gehören fluoreszierende Bildgebung, Immunhistochemie, Western Blot oder histochemische Analyse des Reportergenprodukts5,6,7. Aufgrund der Größenbeschränkung von AAVs ist es jedoch nicht immer möglich, Reportergene einzubeziehen, um die Transduktionseffizienz zu überwachen. Die Verwendung starker Promotoren wie dem hybriden CMV-Enhancer/Chicken Beta-Actin oder woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) als mRNA-Stabilisatorsequenz verkompliziert das Größenproblemweiter 8. Daher wird es auch von Vorteil sein, die Transduktionsrate von injizierten AAVs mit einer direkteren Methodik zu definieren.
Die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) ist eine leistungsstarke Technik zur Quantifizierung der Ziel-DNA aus winzigen Probenmengen. Die dd-PCR-Technologie hängt von der Verkapselung der Ziel-DNA und der PCR-Reaktionsmischung durch Öltröpfchen ab. Jede dd-PCR-Reaktion enthält Tausende von Tröpfchen. Jedes Tröpfchen wird als eigenständige PCR-Reaktion aufbereitet und analysiert9. Die Analyse von Tröpfchen ermöglicht die Berechnung der absoluten Kopienzahl von Ziel-DNA-Molekülen in jeder Probe mithilfe des Poisson-Algorithmus. Da die Transduktionseffizienz der AAVs mit der Kopienzahl von AAV-Genomen in der neuronalen Netzhaut korreliert, verwendeten wir die dd-PCR-Methode, um AAV-Genome zu quantifizieren.
Hier beschreiben wir eine dd-PCR-Methodik zur Berechnung der Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren aus retinaler genomischer DNA6,10. Erstens wurden AAVs, die tdTomato-Reporter exprimieren, unter Verwendung des Small-Scale-Protokolls generiert und durch die dd-PCR-Methode11titeriert. Zweitens wurden AAVs intravitreal in die neuronale Netzhaut injiziert. Um die Transduktionseffizienz zu demonstrieren, haben wir zunächst die tdTomato-Expression mit Fluoreszenzmikroskopie und ImageJ-Software quantifiziert. Es folgte die Isolierung genomischer DNA zur Quantifizierung von AAV-Genomen in injizierten Netzhäuten mittels dd-PCR. Der Vergleich der tdTomato-Expressionsniveaus mit den transduzierten AAV-Genomen, die durch die dd-PCR quantifiziert wurden, zeigte, dass die dd-PCR-Methode die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren genau quantifizierte. Unsere Protokolle zeigten eine detaillierte Beschreibung einer dd-PCR-basierten Methodik zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz. In diesem Protokoll zeigen wir auch die absolute Anzahl der AAV-Genome, die nach intravitrealen Injektionen transduziert werden, indem einfach der Verdünnungsfaktor nach der genomischen DNA-Isolierung und die dd-PCR-Ergebnisse verwendet werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine leistungsfähige Methode, die eine Alternative zur Reporterexpression wäre, um die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren in der Netzhaut zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir zwei AAV-Vektoren mit unterschiedlichen Kapsidproteinen generiert und diese dann entsprechend titeriert. Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls besteht darin, ausreichende Mengen an AAVs zu erzeugen, die nach der Transduktion12,13eine nachweisbare Reporterexpression ergeben.
Die Titerierung von AAVs ist auch ein wichtiger Faktor, um die Dosierung von AAV für intravitreale Injektionen anzupass…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Oezkan Keles, Josephine Jüttner und Prof. Botond Roska, Institut für Molekulare und Klinische Ophthalmologie Basel, Complex Viruses Platform für ihre Hilfe und Unterstützung bei der AAV-Produktion. Wir möchten uns auch bei Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, der University of Pennsylvania, für den AAV8/BP2-Stamm bedanken. Tierarbeiten werden in der Tieranlage der Technischen Universität Gebze durchgeführt. Dafür danken wir Leyla Dikmetas und Prof. Uygar Halis Tazebay für die technische Hilfe und Unterstützung bei der Tierhaltung. Wir danken auch Dr. Fatma Özdemir für ihre Anmerkungen zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch TUBITAK, Fördernummern 118C226 und 121N275, und Sabanci University Integration Grant unterstützt.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
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