El protocolo actual presenta un método rápido, eficiente y suave para aislar células individuales adecuadas para el análisis de ARN-seq de una sola célula a partir de un incisivo de ratón en crecimiento continuo, molar de ratón y dientes humanos.
Los dientes de ratón y humanos representan órganos desafiantes para el aislamiento celular rápido y eficiente para aplicaciones transcriptómicas u otras aplicaciones unicelulares. El tejido pulpar dental, rico en la matriz extracelular, requiere un largo y tedioso proceso de disociación que generalmente está más allá del tiempo razonable para la transcriptómica de una sola célula. Para evitar cambios artificiales en la expresión génica, el tiempo transcurrido desde la eutanasia de un animal hasta el análisis de células individuales debe minimizarse. Este trabajo presenta un protocolo rápido que permite obtener suspensión unicelular de dientes de ratón y humanos en una excelente calidad adecuada para scRNA-seq (secuenciación de ARN unicelular). Este protocolo se basa en pasos acelerados de aislamiento tisular, digestión enzimática y posterior preparación de la suspensión final unicelular. Esto permite un procesamiento rápido y suave de los tejidos y permite utilizar más muestras animales o humanas para obtener suspensiones celulares con alta viabilidad y cambios transcripcionales mínimos. Se anticipa que este protocolo podría guiar a los investigadores interesados en realizar el scRNA-seq no solo en los dientes de ratón o humanos, sino también en otros tejidos ricos en matriz extracelular, incluido el cartílago, el tejido conectivo denso y la dermis.
La secuenciación de ARN unicelular es una poderosa herramienta para descifrar la estructura, jerarquía, interacciones y homeostasis de la población celular de vivo1,2. Sin embargo, sus resultados dependen en gran medida del primer paso de este análisis avanzado: la preparación de una suspensión unicelular de calidad perfecta a partir del tejido complejo y bien organizado. Esto abarca mantener las células vivas y prevenir cambios artificiales no deseados en los perfiles de expresión génica de las células3,4. Tales cambios podrían conducir a una caracterización inexacta de la estructura de la población y a una interpretación errónea de los datos recopilados.
Se han desarrollado protocolos específicos para el aislamiento de una amplia gama de tejidos5,6,7,8. Por lo general, emplean la disociación mecánica en combinación con una incubación adicional con varias enzimas proteolíticas. Estos típicamente incluyen tripsina, colagenasas, dispasas, papaína6,7,8,9, o mezclas de enzimas disponibles comercialmente como Accutase, Tryple, etc.5. La parte más crítica que afecta la calidad del transcriptoma es la digestión enzimática. Se demostró que la incubación prolongada con enzimas a 37 °C influye en la expresión génica y provoca la regulación al alza de muchos genes relacionados con el estrés10,11,12,13. El otro parámetro crítico del proceso de aislamiento es su longitud total, ya que se ha demostrado que los transcriptomas celulares cambian después de la isquemia tisular14. Este protocolo presenta un protocolo eficiente para el aislamiento suave de células individuales de dientes de ratón y humanos, más rápido que otros protocolos utilizados anteriormente para el aislamiento de células de tejidos complejos5,6,9,11,13,15,16.
Este protocolo presenta cómo diseccionar rápidamente el tejido blando del diente duro y preparar una suspensión unicelular adecuada para scRNA-seq. Este método emplea solo un paso de centrifugación y minimiza el efecto de los cambios transcripcionales no deseados al reducir el manejo del tejido y el tiempo de digestión y mantener el tejido y las células a 4 ° C la mayor parte del tiempo. El procedimiento muestra el aislamiento de células de incisivos de ratón, molares y muelas del juicio humanas como ejemplo, pero principalmente debería funcionar para otros dientes en varios organismos. El protocolo completo se visualiza esquemáticamente en la Figura 1. Este protocolo se ha utilizado recientemente para generar un atlas de tipo celular dental obtenido de dientes de ratón y humanos1.
El estudio de dientes y huesos a nivel celular o molecular es generalmente un desafío, ya que las células que forman estos tejidos están rodeadas por diferentes tipos de matrices duras19. Uno de los principales objetivos para realizar RNA-seq unicelular en el tejido dental es la necesidad de obtener células de interés rápidamente y sin ningún cambio artificial en sus transcriptomas. Para lograr esto, se desarrolló un protocolo altamente eficiente adecuado para aislar células de pulpas dentales de ratón y humanos, lo que permite la generación rápida de suspensiones unicelulares para todas las aplicaciones transcriptómicas. Esto se aseguró mediante el aislamiento rápido de tejidos, minimizando los pasos de las manipulaciones de tejidos y células, y racionalizando la digestión mecánica y enzimática.
Los pasos más críticos de este protocolo son el procesamiento rápido de tejidos y la preparación adecuada de la suspensión unicelular8,9. Se utiliza un enfoque manual para obtener pulpas dentales sin utilizar un taladro dental u otros dispositivos generadores de calor. El sobrecalentamiento puede causar una expresión artificial de proteínas de choque térmico y otros genes, lo que en última instancia lleva a que los patrones de expresión génica analizados no sean representativos del tejido original20. La recolección manual de tejidos puede ser un paso desafiante que probablemente necesitará algo de entrenamiento de antemano. La pulpa se corta en trozos pequeños y se digiere enzimáticamente a 37 °C. A excepción de los 15-20 min de digestión enzimática, todo el protocolo se realiza a 4 °C. El procesamiento tisular y especialmente la digestión enzimática se minimizaron al menor tiempo posible, ya que una incubación más prolongada a 37 °C puede provocar cambios en los patrones de expresión génica10. Se recomienda la eliminación mecánica de la dentina antes de la digestión enzimática. La dentina y la predentina unida a la pulpa contienen una gran cantidad de colágeno, y su presencia excesiva podría disminuir la efectividad de la solución de digestión. Después de ser eliminadas del cuerpo (o la muerte de los organismos), se demostró que las células comienzan a modificar sus patrones de expresión génica rápidamente12. Por lo tanto, el aislamiento y procesamiento celular debe llevarse a cabo lo más rápido posible. El protocolo actual reduce el tiempo de procesamiento a 35-45 minutos desde el aislamiento del tejido (eutanasia animal) hasta la preparación de la suspensión unicelular.
Una modificación alternativa de esta técnica es la preservación celular para su uso posterior. Esto se logra mediante la fijación de metanol. La suspensión de célula fija de metanol puede almacenarse hasta 1 mes a -80 °C, como se describe en el protocolo21. Sin embargo, siempre que sea posible, realizar scRNA-seq directamente, ya que se demostró que los datos unicelulares de suspensiones unicelulares fijadas con metanol podrían sufrir una mayor expresión de genes relacionados con el estrés y contaminación con ARN ambiental22. Este paso puede necesitar modificaciones adicionales de acuerdo con los protocolos del fabricante.
Antes de la primera aplicación de este protocolo, se recomienda realizar varios pasos de validación para probar la técnica. Desde nuestra experiencia, sugerimos probar los pasos críticos antes mencionados del protocolo. Además, sugerimos probar la efectividad de la solución de colagenasa P y probar el manejo de la etapa de disociación tisular. Específicamente, alrededor de los primeros 5 minutos después del inicio de la incubación de la colagenasa P, los trozos de tejido deben agregarse. Esta es una situación común. Los agregados se desintegran cada 3-4 minutos utilizando una pipeta de 1 ml, y con el aumento del tiempo, deben hacerse más pequeños hasta apenas visibles.
Además, se recomienda realizar el conteo celular en una cámara de conteo celular antes de la centrifugación y antes y después del filtrado para detectar posibles pérdidas celulares debido a la eliminación subóptima del sobrenadante. Si la suspensión final de una sola célula necesita ser purificada, se puede utilizar FACS. La clasificación celular no solo permite eliminar escombros o células muertas, sino que también permite enriquecer la suspensión final con células marcadas fluorescentemente13,19. Para evitar la tensión cortante o la obstrucción del clasificador celular, se utiliza una boquilla ancha (85 μm o 100 μm). Esto mejorará aún más la viabilidad de las células clasificadas.
Esta técnica fue diseñada y probada tanto en dientes de ratón como humanos. El principal factor limitante es el pequeño número de células en las pulpas dentales reducidas de los dientes de ratones más viejos (molares) y humanos. Supongamos que se necesita obtener un mayor número de células o que se van a adquirir células de los dientes de pacientes mayores. Una posible solución es procesar un mayor número de dientes y fusionarlos en un solo lote, posteriormente procesados como una muestra.
Las células vivas de la pulpa dental humana se aislaron por primera vez hace más de veinte años utilizando una mezcla enzimática de colagenasa I y dispasa23. Desde entonces, los aislamientos de las células de la pulpa dental se utilizaron ampliamente, y se han utilizado varias técnicas5,6,7,8. La importancia crítica del método presentado aquí es la adaptación de todos los pasos de aislamiento para hacer que el aislamiento sea rápido y suave para garantizar la alta calidad de la suspensión celular final para scRNA-seq. Se puede obtener un mayor rendimiento celular mediante una incubación más prolongada con enzimas. Este protocolo proporciona una solución eficiente para obtener rápidamente células individuales de dientes de ratón y humanos de calidad adecuada para la secuenciación de ARN unicelular. Se espera que esta técnica sea ampliamente utilizada para otros tejidos u organismos con solo ligeras modificaciones técnicas.
The authors have nothing to disclose.
J.K. fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la Universidad de Masaryk (MUNI/H/1615/2018) y por fondos de la Facultad de Medicina MU a investigador junior. J.L. fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la Universidad de Masaryk, (MUNI/IGA/1532/2020) y es becario de Brno Ph.D. Talent Scholarship- Financiado por el Municipio de la Ciudad de Brno. T.B. fue apoyado por el Fondo Austriaco para la Ciencia (beca Lise Meitner: M2688-B28). Agradecemos a Lydie Izakovicova Holla y Veronika Kovar Matejova por su ayuda con la obtención de dientes humanos. Finalmente, agradecemos a Radek Fedr y Karel Soucek por su amable asistencia con la clasificación de FACS.
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |