Foto nedbrytbare Hydrogel-grensesnitt for bakteriescreening, utvelgelse og isolasjon

Summary

Bruk av foto nedbrytbare hydrogeler for å isolere bakterieceller ved hjelp av et høyoppløselig lys patteringsverktøy rapporteres. Viktige eksperimentelle prosedyrer, resultater og fordeler ved prosessen gjennomgås. Metoden muliggjør rask og billig isolering av målrettede bakterier som viser sjeldne eller unike funksjoner fra heterogene samfunn eller populasjoner.

Abstract

Biologer har lenge forsøkt å forstå forholdet mellom fenotype og genotype. For bedre å forstå denne forbindelsen er det avgjørende å utvikle praktiske teknologier som kombinerer mikroskopisk cellescreening med celleisolasjon ved høy renhet for nedstrøms genetisk analyse. Her beskrives bruk av fotodegraderbare poly(etylenglykol) hydrogeler for screening og isolering av bakterier med unike vekstfenotyper fra heterogene cellepopulasjoner. Metoden er avhengig av å innkapsle eller fange celler med hydrogelen, etterfulgt av kultur, mikroskopisk screening, og deretter bruke et høyoppløselig lysmønsterverktøy for romlig kontroll av hydrogelforringelse og frigjøring av utvalgte celler til en løsning for gjenfinning. Bruk av forskjellige lysmønstre gir mulighet for kontroll over morfologien til den ekstraherte cellen, og mønstre som ringer eller kryss kan brukes til å hente celler med minimal direkte UV-lyseksponering for å redusere DNA-skade på isolasjonene. Videre gir lysmønsterverktøyet en justerbar lysdose for å oppnå ulike nedbrytnings- og celleutløsningshastigheter. Det gir forringelse ved høy oppløsning, noe som muliggjør celleuthenting med mikronskala romlig presisjon. Her demonstreres bruken av dette materialet for å screene og hente bakterier fra både bulkhydrgeler og mikrofabricated lab-on-a-chip-enheter. Metoden er billig, enkel og kan brukes til vanlige og nye anvendelser i mikrobiologi, inkludert isolering av bakteriestammer med sjeldne vekstprofiler fra mutante biblioteker og isolering av bakteriekonsortier med fremvoksende fenotyper for genomiske karakteriseringer.

Introduction

Isolering av celler med unik oppførsel fra et komplekst og heterogent miljø er grunnleggende for å skaffe genetisk informasjon i biologi¹. I mikrobiologi blir valg og isolering av sjeldne eller unike mikrober etter observasjon viktig i mange applikasjoner som krever en sammenheng mellom genomisk informasjon og observerbar fenotypisk informasjon. Disse bruksområdene inkluderer valg av fenotypisk sjeldne stammer fra mutantbibliotekene², valg av keystone-mikroorganismer fra komplekse mikrobielle samfunn^3,4og valg av fenotypisk sjeldne, men viktige bakterier fra isogene populasjoner. Isolering av levedyktige, men ikke-culturable celler (VBNC) fra en bakteriepopulasjon er et viktig eksempel på sistnevnte, hvor celler med VBNC-fenotypen ofte er skjult i bakteriepopulasjoner ved 1:10² til 1:10⁵ forhold^5,6. På grunn av de utbredte vanskelighetene i bakterieisolasjon, er mye fortsatt ukjent om mange fenotypisk sjeldne mikroorganismer. Disse begrensningene understreker behovet for celleisolasjonsteknikker for først å identifisere målcellen eller -cellene fra en blanding og deretter hente og isolere dem for nedstrøms molekylær analyse⁷.

Noen av de mest etablerte metodene for celleisolasjon inkluderer strømningscytometri og fluorescerende aktivert cellesortering (FACS)⁸, immunomagnetisk separasjon^9,10og mikrofluidikk¹¹. Selv om disse isolasjonsmetodene har høy verdi, har de også ulemper som begrenser bruken av dem. FOR eksempel kan FACS gi rutinemessig mikrobiell isolasjon på encellet nivå for oppfølging genomisk analyse^3, men er ofte begrenset av tilgjengelighet og utgifter, samt nedstrøms forurensningsproblemer¹¹. Mikrofluidbaserte tilnærminger som mikrofluid strømningscytometri har fått mye oppmerksomhet, som sammenlignet med konvensjonell strømningscytometri gir en betydelig reduksjon i prøvevolumet som kreves¹². Separasjon og gjenfinning av individuelle eller små samlinger av celler fra mikrofluidiske enheter er imidlertid ofte et utfordrende problem som vanligvis krever et mer komplekst oppsett og enhetsdesign¹³. Mange mikrofluidbaserte tilnærminger genetisk karakteriserer celler før de legges inn og observeres i en enhet¹⁴, og begrenser antall unike arter som observeres når de utfører en funksjonell skjerm. Gitt disse begrensningene, er det nødvendig med ytterligere innovasjon av både metoder og materialer som er praktiske for cellescreening og isolasjon for utbredt bruk i mange laboratorier.

Dette dokumentet presenterer en ny, materialbasert tilnærming for bakteriescreening og isolasjon. Metoden bruker foto nedbrytbare hydrogeler for celleinnkapsling, kultur, mikroskopisk observasjon og behovsbetinget frigjøring og gjenoppretting av målrettede bakterier med unike fenotyper. Hydrogeler er designet for å inneholde 10 nm maskestørrelse, hvor hver krysskobling inneholder o-nitrobenzyl gruppe¹⁵. Materialet innkapsler eller fanger celler for observasjon samtidig som diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter kan spres til og fra celler for kultur. Å utsette materialet for en mønstret 365 nm UV-lyskilde gjennom et oppreist mikroskop muliggjør lokal nedbrytning av hydrogelen gjennom fotocleavage av o-nitrobenzyl gruppe^16,17. Nedbrytning utløser selektiv frigjøring av celler for utvinning for nedstrømsanalyse, inkludert genomisk og potensielt proteomisk og transremisk analyse. Det eksperimentelle oppsettet og protokollen er relativt enkel, billig og translasjonell til mikrobiologiske laboratorier. Det krever bare celleinnkapsling gjennom hydrogeldannelse, observasjon av fangede celler med oppreist brightfield og fluorescensmikroskop, og belysning av celler av interesse med en mønstret UV-lyskilde for gjenfinning.

En viktig fordel med denne materialbaserte tilnærmingen til screening er tilpasningsevnen til forskjellige screeningformater. I sitt mest grunnleggende format kan materialet brukes til screening ved å innkapsle en heterogen cellesamling i bulkhydrgeler. Celler observeres deretter for ønsket fenotype, og individuelle celler av interesse fjernes for genomisk karakterisering. I mer forseggjorte formater kan materialet også integreres i lab-on-a-chip-enheter for å gi presis celleutløsning og gjenfinning fra ønskede områder av enheten. Begge formatene er beskrevet her, og begge har aktivert nyere nye mikrobielle screening- og utvalgsprogrammer^17,18,19. Metoden er demonstrert her med modell Gram-negative organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) og en modell Gram-positiv organisme (Bacillus subtilis) og har lett blitt utvidet til en rekke andre bakterier.

Protocol

1. Bakteriestammer og kulturprotokoller Streak kolonier av bakterier på agarplater supplert med passende vekstmedier. I denne rapporten er B. subtilis (stamme 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) er dyrket på ATGN (0.079 M KH2PO4,0.015 M (NH4)2SO4,0.6 mM MgSO4·7H2O, 0.06 mM CaCl2·2H2O, 0.0071 mM MnSO4· H2O, 0,125 M FeSO4· 7H2O, 28 mM glukose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/l agar) agarplater supplert med 100 μg/ml spectinomycin og E. coli (stamme 25922, ATCC) på ATGN agarplater supplert med 100 μg/ml ampicillin.MERK: Tidligere rapporter om hydrogelinnkapsling og frigjøring med disse materialene fra Fattahi et al.19 brukte i stedet A. tumefaciens C58 celler Velg ønskede kolonier fra ATGN agarplater og start nattkulturer. For E. coli og B. subtilis stammer som brukes her, kultur ved 37 °C mens du rister ved 215 o/min i ATGN flytende medium i 24 timer. Oppbevar cellekulturene i 50% glyserol ved -80 °C til fremtidig bruk. Velg kolonier av begge stammer fra glyserollagre ved hjelp av sterile inokulasjonsløkker og inkuber i ATGN flytende medier i 24 timer ved 37 °C og 215 o/min. 2. Fremstilling av materialet som trengs for hydrogeldannelse Foto nedbrytbar PEG-o-NB-diakrylat synteseMERK: Den interne syntesen av PEG- o-NB-diakrylaten er godt beskrevet og tidligere rapportert16,17. Alternativt, fordi syntesen er rutinemessig, kan den outsources fra et kjemisk synteseanlegg. Buffer for krysskobling Ta oppskriften på det valgte mediet for bakteriestammen og lag medier med 2x næringsstoffer. Tilsett fosfat, for eksempel NaH2PO4, til mediet til en endelig konsentrasjon på 100 mM. Juster deretter pH-verdien til 8 ved hjelp av 5 M NaOH (aq). Steriliser bufferløsningen og oppbevar den ved -20 °C til videre bruk.MERK: Utelat eventuelle overgangsmetaller som finnes i media, da disse metallene katalyserer oksidasjonen av tiolene til disulfider. PEG-o-NB-diakrylat oppløsning For hver mg av aliquot PEG- o-NB-diakrylat (3400 Da molekylvekt) pulver, tilsett 3,08 μL ultrarent vann for å nå 49 mM konsentrasjon av PEG-o-NB-diakrylat(98 mM akrylatkonsentrasjon). Virvel oppløsningen til den er godt blandet og oppbevar denne oppløsningen ved -20 °C til videre bruk. 4-arm PEG-tiol oppløsning For 4-arm PEG-thiol (10,000 Da molekylvekt) forberedelse, tilsett 4 μL ultrapure vann per mg pulver for å nå en 20 mM konsentrasjon (80 mM tiol konsentrasjon). Virvel denne løsningen til den er godt blandet og oppbevar denne oppløsningen ved -20 °C til videre bruk. 3. Tilberedning av perfluoroalkylaterte (ikke-reaktive) deksler Plasser opptil 5 glasssklier (25 mm x 75 mm x 1 mm) inne i en skyvepost av polypropylen. Soniker lysbildene med en 2% (w / v) vaskemiddelløsning (Materialbord) i 20 min. Skyll lysbildene tre ganger med ultrarent vann, og soniker deretter lysbildene i vann i 20 minutter. Tørk lysbildene med en strøm av N2. Plasmarengjøring (se Materialfortegnelse) på begge sider av glasset glir i henhold til protokollen i pkt. 4.1 i 2 min. Plasser plasmarensede lysbilder tilbake i lysbildepostsederen og fyll beholderen med en 0,5% (v / v) løsning av trichloro (1H, 1H, 2H, 2H, perfluorooctyl) silan i toluen. La disse glasssklierene fungere i 3 timer ved romtemperatur (RT). Etter at lysbildene er funksjonalisert, skyll lysbildene i lysbildesvareren, først med toluen og neste etanol (tre ganger med hvert løsningsmiddel). Tørk deretter hvert funksjonaliserte lysbilde med en strøm på N2. 4. Fremstilling av thiol funksjonaliserte (base) deksler Rengjøring av glassdekslene ved hjelp av en plasmarenser Legg 18 mm x 18 mm deksler i en Petri-tallerken. Plasser deretter Petri-parabolen i et plasmarenserkammer og slå på plasmarenserens kraft. Slå på vakuumpumpen for å fjerne luften i kammeret til trykkmåleren viser 400 mTorr. Åpne måleventilen for å slippe luft inn i kammeret til trykkmåleren når et jevnt trykk (800-1000 mTorr). Velg deretter RF med “Hi” -modus og eksponer dekslene i 3 minutter. Etter 3 min, slå av RF-modus og vakuumpumpe. Ta Petri-parabolen ut av kammeret, vend dekslene og legg dem tilbake i kammeret for å plasma eksponere den andre siden av glassdekslene. Gjenta trinn 4.1.2-4.1.4 for å plasmarense den ubehandlede siden av glassdekslene. Etter å ha fullført prosessen, fjern Petri-parabolen fra kammeret og slå av plasmarenseren og støvsugeren. Rengjøring og hydroksylering av dekslene med piranha-løsningMERK: Standard piranha rengjøringsprotokoller kan brukes til å rengjøre og hydroksylere glassslipper. Piranha-løsningen er en 30:70 (v/v) blanding av H2O2 og H2SO4. Alternative metoder for rengjøring av glassdeksler kan også brukes.FORSIKTIG: Piranha-løsningen er sterkt korrosiv og eksplosiv med organiske løsemidler og bør håndteres med stor forsiktighet. Passende sikkerhets- og inneslutningstiltak bør iverksettes, for eksempel bruk av riktig personlig verneutstyr (labfrakk, kjemisk motstandsdyktig forkle, vernebriller, ansiktsskjerm, syrefaste butylhansker). Alt glass og arbeidsflater i kontakt med piranha-oppløsningen skal være rene, tørre og fri for organiske rester før bruk. Piranha-oppløsning skal aldri oppbevares i en delvis lukket eller lukket beholder. Plasser en ren 100 mm x 50 mm glassfat på en magnetisk varmeplaterører med justerbar rørehastighet under en avtrekkshette og tilsett 14 ml H2SO4 i fatet. Legg forsiktig en liten, teflonbelagt magnetisk rørestang ved hjelp av teflonbelagte tang inne i parabolen. Drei deretter røreren sakte for å unngå sprut av syren. Deretter tilsetter du forsiktig 6 ml H2O2 i parabolen og lar løsningen bli godt blandet. Slå av røreren, og fjern deretter rørestangen fra parabolen ved hjelp av tangene. Deretter plasserer du dekslene forsiktig inne i parabolen ved hjelp av tangene og setter temperaturen til 60-80 °C. Etter 30 min fjerner du forsiktig dekslene ved hjelp av tangene og nedsenker dem i deionisert vann (DI) vann to ganger for å vaske av gjenværende piranha-løsning. Etter skylling med vann, oppbevar dekslene i DI-vann ved RT inntil videre bruk. Slå av kokeplaten og la piranhaløsningen avkjøles. For å kaste piranha-oppløsningen, plasser forsiktig 100 mm x 50 mm glassfatet som inneholder den avkjølte piranha-løsningen i et større, tomt glassbeger som er minst 1,5 l i volum. Tilsett deretter 1 liter vann for å fortynne og tilsett natriumbikarbonatpulver for å nøytralisere. Vær oppmerksom på at natriumbikarbonat vil forårsake boblende og varmegenerering og bør tilsetts veldig sakte, ellers kan boblende føre til sprut av syren. Når ytterligere tilsetning av natriumbikarbonat ikke forårsaker boblende, kontroller pH med pH-papir for å kontrollere at det er nøytralisert. Når løsningen er nøytralisert og avkjølt, kan den helles ned i vasken. Thiol funksjonalisering av dekslene Forbered en 5% (v / v) løsning på 269 mM (3-mercaptopropyl) trimetoksysilane (MPTS) løsning i tørr toluen. Tilsett 10 ml av løsningen til individuelle koniske sentrifugerør på 50 ml og legg en rengjort deksle i hvert rør og senk den ned i løsningen.MERK: En dekslelip per 50 ml rør brukes til å sikre tiolasjon av begge sider av substratet uten å bli forstyrret av andre substrater. Etter 4 timer, vask hver dekslelip (fire vasker per dekslerlip) med toluen, en 1:1 (v / v) etanol: toluenblanding og etanol.MERK: Dette gjøres ved å nedsenke hvert deksle sekvensielt i koniske sentrifugerør som inneholder de nevnte løsningene. Etter skylling av substratet, senk dem ned i etanol og oppbevar dem ved 4 °C til videre bruk.MERK: Avhengig av antall coverlips, kan denne metoden bli arbeidskrevende på grunn av behandling av deksler en om gangen. For flere coverlips kan Columbia-krukker som passer til flere deksler samtidig brukes. 5. Fabrikasjon av silisiummikrowell arrayer Parylenbelegg: Bruk standardprotokollen som er beskrevet i tidligere forskningsartikler20,21 for å belegge silisiumskiver med parylen. Mikrofabrikasjon: Følg protokollen beskrevet av Barua et al.18 for å designe og fremstille mikrowellmatrisen (Supplerende figur 1).MERK: Standard fotolittografiske teknikker beskrevet av Timm et al.17 ble brukt til å fremstille mikrowell-arrayer på parylenbelagte silisiumskiver. 6. Hydrogelformasjonen Bulk hydrogeldannelse på glassdeksler Hydrogel forløperløsning: Tilsett 12,5 μL av krysskoblingsbufferen til et 0,5 ml mikrosenterrør, etterfulgt av 5,6 μL PEG- o-NB-diakrylatoppløsning. Til slutt tilsett 6,9 μL 4-arm PEG-thiol-løsning til blandingen.MERK: Hvis du tilsetter 4-arm PEG-tiolen i blandingen, starter du krysskoblingsreaksjonen. Dermed bør hydrogelforløperløsningen brukes umiddelbart etter blanding. For celleinnkapsling i hydrogelforløperløsningen følger du trinn 6.1.3-6.1.9. For celleinnkapsling, før trinn 6.1.1, inokulerer du krysskoblingsbufferen med ønsket celletetthet. Som rapportert tidligere19, ble det observert at celletetthet på 7,26 × 107 CFU / ml i krysskoblingsbufferen korrelerer med en tetthet på ~ 90 celler / mm2 innkapslet over hydrogelen. Legg den tiolerte bunndekslene på en ren Petri-tallerken. Plasser to avstandsstykker (se Materialliste) på de to motstående sidene av dekslene.MERK: Thiol-funksjonalisering av dekslene er nødvendig for kovalente festing av hydrogelen til dekslene. Dette gjøres gjennom reaksjon av tiolgrupper på overflaten og akrylatgruppene som er tilstede i hydrogelforløperløsningen. Fest avstandsstykkene på bunndekslene ved å teipe avstandsstykkene til Petri-parabolen. Pipette ønsket volum av forløperløsningen på en ikke-reaktiv, perfluoroalkylert glasssklie. Plasser den perfluoroalkylaterte glasssklie på bunndekslene (Figur 1C). Vent i 25 min på RT for at hydrogelformasjonen skal fullføres. Etter gelering fjerner du forsiktig den perfluoroalkylaterte glasssklie. Hydrogelen vil holde seg festet til bunndekslene.MERK: For 18 mm x 8 mm deksler for å oppnå en 12,7 μm tykk membran, bruk ~7 μL av forløperløsningen (Figur 1A, B). Bruk av høyere mengder forløperløsning kan føre til hydrogel under sokkeldekslene. Dette kan føre til at bunndekslene fester seg til Petri-parabolen og bryter på et forsøk på fjerning. Også hydrogelrester under dekslet er problematisk for mikroskopi. Forsiktig fjerning av den ikke-reaktive perfluoroalkylaterte glasssklie er nødvendig, da rask fjerning kan skade hydrogelen. Plasser substratet i en 60 mm x 15 mm Petri-tallerken i spesifiserte kulturmedier. Her ble ATGN-medier supplert med 100 μg/ml spectinomycin for B. subtilis eller 100 μg/ml ampicillin for E.coli ved 37 °C ble brukt i 24 timers kulturtid. Figur 1: Hydrogeldannelse på tiolerte glassdeksler. (A) Avstandsstykker med en tykkelse på 12,7 μm plasseres på to motsatte sider av en basedeksler som inneholder reaktive tiolgrupper. (B) Hydrogelforløperløsningen pipetteres over en ikke-reaktiv, fluorisert glasssklie. (C) Den ikke-reaktive glasssklie er plassert på avstandsstykkene for dannelsen av 12,7 μm tykk hydrogel. (D) Den ikke-reaktive glasssklie fjernes forsiktig, slik at hydrogelen er festet til bunndekslene. (E) Den tilberedte hydrogelen kan inkuberes i media for kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 7. Hydrogeldannelse over mikrowell arrayer Bakterier sådd i mikrowell arraysMERK: 700 μL av 0,1 OD600 celle suspensjoner ble sådd over mikrowell array substrater, og parylen lift-off metoden ble brukt til å fjerne celler fra bakgrunnen ved hjelp av protokollen beskrevet av Timm et al. 22. Forbered hydrogelforløperløsningen ved å tilsette 5,6μL PEG- o-NB-diakrylat med 12,5 μL pH 8 fosfatbufret saltvanns-ATGN og bland med 6,9 μL av den firearmede PEG-tiolløsningen. Pipette 12,5 μL av forløperløsningen på en ikke-reaktiv, perfluoroalkylert glasssklie og plasser to 38 μm stål avstandsstykker (se Tabell over materialer) på to motstående sider av mikrowell array substratet inokulert med celler. Inverter perfluoroalkylert glasssklie med forløperoppløsningsdråpen og plasser dråpen midt i mikrowellsubstratet. Deretter inkuberes i 25 min ved RT for hydrogeldannelse. Fjern glasssklie forsiktig fra mikrowell-substratet. Hydrogelmembranen skal forbli festet til mikrowellsubstratet. Fortsett til trinn 6.1.9. 8. Materialforberedelse for celleutvinning Forberedelse av PDMS-holder Tape en stabel med ti 18 x 18 mm deksler sammen og lim denne bunken med deksler til bunnen av en Petri-tallerken. For å fremstille PDMS-holdere, bland PDMS forløper og herdemiddel med et forhold på 10: 1 volumforhold i en plastkopp, degas blandingen i en vakuumdesiccator, og hell deretter blandingen i Petri-parabolen. Herd PDMS i 90 min ved 80 °C. Klipp deretter rundt den teipede blokken for å fjerne PDMS-holderen og plasser PDMS-holderen på en glasssklie for enklere håndtering for mikroskopi. Mikrosyring og rørforberedelse Klipp 20 cm PTFE-slange (0,05 i I.D.) og fest den ene enden av slangen til en 100 μL mikrolitersprøyte.MERK: For ekstraksjon må du unngå å bruke pipetter, da det å tegne de frigjorte cellene via en pipettespiss kan skade hydrogeloverflaten og føre til forurensning. 9. Hydrogel nedbrytning med det mønstrede belysningsverktøyet MERK: Følgende trinn som er beskrevet i denne delen, er identiske for både bulkhydrgeler og mikrowellmatriser, bortsett fra lyseksponeringsmønstrene som er beskrevet i trinn 9.6.4-9.6.6 og 9.6.7-9.6.10. Slå på mikroskopet (se Materialtabell). Slå deretter på det mønstrede belysningsverktøyet (se Materialtabell). Slå på den 365 nm LED-lyskilden Analog og digital kontrollmodul. Slå deretter på KONTROLLMODULEN for LED-lyskilde. Åpne mikroskopprogramvaren og programvaren for det mønstrede belysningsverktøyet. Når vinduet for maskinvarekonfigurasjon åpnes, velger du Last inn .MERK: Tre enheter lastes inn her. (Tredjepartskamera, en kontrollmodul og det mønstrede belysningsverktøyet) Trykk på Start-knappen. Programvarevinduet for lysmønster åpnes nå. Velg det første alternativet, Enhetskontroll-knappen, på venstre sidefelt i vinduet. Kalibrer det mønstrede belysningsverktøyet.MERK: Kalibrering må gjøres med samme mikroskopmål og filter som skal brukes til lyseksponering. Sett mikroskopmålet til 10x forstørrelse.MERK: Denne forstørrelsen gir nok arbeidsavstand mellom mikroskoplinsen og prøveoverflaten. Det gjør det også mulig å overvåke og registrere gjenfinningsprosessen i sanntid gjennom bildevinduet. Sett mikroskoplinsen og filteret til innstillingene som brukes for lyseksponering, og plasser kalibreringsspeilet under mikroskopet. Trykk på LED-kontrollfanen i enhetskontrollvinduet. Slå på LED #1 og sett lysintensiteten til ønsket nummer. I standard utvinningseksperimenter er dette satt til 60%. Trykk på fanen med navnet på produktnavnet til det mønstrede belysningsverktøyet i enhetskontrollvinduet. Trykk deretter Vis rutenett-knappen.MERK: Et rutenettmønster projiseres på kalibreringsspeilet. Juster mikroskopfokuset og kameraeksponeringen for å oppnå høy bildekvalitet på rutenettet, og roter kameraet for å justere rutenettlinjene parallelt med kameraets vindusramme om nødvendig. Velg Kalibreringsveiviser-knappen under fanen med tittelen produktnavnet for det mønstrede belysningsverktøyet, og følg instruksjonene fra programvaren i dette vinduet.MERK: Et kameraoppsettvindu fra en tredjepart åpnes. Et vindu for valg av kalibreringstype åpnes. Velg Automatisk kalibrering , og trykk Neste. Når vinduet Forkalibreringsjustering åpnes, følger du programvareinstruksjonene og trykker på Neste-knappen. Når vinduet Tilordningsinformasjon åpnes, lagrer du denne kalibreringen i henhold til ønsket mappe. Dette gjøres ved å sette inn dato, mikroskopnavn, objektiv objektiv og filter. Etter kalibrering trykker du på knappen Definisjon av arbeidsområde som du finner under fanen med produktnavnet for det mønstrede belysningsverktøyet for å definere arbeidsområdet til det mønstrede belysningsverktøyet om nødvendig. Sekvensutformingsdelen for mønsterforberedelse. Trykk på Sekvensutforming-knappen på venstre sidefelt i programvarevinduet. Trykk deretter på Knappen Redigeringsprogram for profilsekvens. Når vinduet Profilsekvensredigering åpnes, velger du alternativet Ny profil under Profilliste.MERK: Nå åpnes et Mønsterredigering-vindu. Forbered ønsket mønster for lyseksponering ved å velge forskjellige mønsterformer og -størrelser, eller tegn mønsteret manuelt, hvis ønskelig. For sirkel- og brutte kryssmønstre for bulkhydrgelen følger du trinn 9.6.5- 9.6.6 For sirkelmønstre definerer du en sirkel med en diameter på 30 μm over en målbakteriekoloni for å dekke hele kolonien. Velg figuren fyllfarge hvit. For brutte kryssmønstre velger du rektangelfiguren fra mønstertegningsvinduet med dimensjoner på 3 μm x 8 μm. Plasser fire rektangler med denne dimensjonen på kantene av målkolonien, mens halvparten av mønstrene har et overlegg med kolonien. For sirkel- og ringemønstre for mikrowellmatrisene følger du trinn 9.6.8-9.6.10. For sirkelmønstre tegner du en sirkel med en diameter på 10 μm rundt brønnperimeteren. Velg figuren fyllfarge hvit. For ringmønsteret tegner du en sirkel med diameter 20 μm, plasserer den over brønnen og velger formfyllfargen hvit. Tegn et annet sirkelmønster med diameter 10 μm med fyllformfarge svart og plasser den rundt omkretsen av brønnen. Rediger mønsteret og endre figurene basert på ønsket uttrekkingsmetode. Påse at ønsket mønster finnes innenfor arbeidsområdet til det mønstrede belysningsverktøyet. Plasser prøven i en PDMS-holder og pipette det definerte mediet oppå prøven for å forhindre prøvedehydrering og gi en bæreløsning for frigitte celler. Deretter erstatter du dette med kalibreringsspeilet. Juster mikroskopfokuset for å få et skarpt bilde av koloniene i hydrogelen. Inspiser koloniene for å identifisere en koloni av interesse. Her utformer du lysmønstrene mens kameravisningen viser koloniene i prøven for å teste forskjellige mønstre for celleuttrekking. Lagre det definerte mønsteret. Når du har lagret det definerte mønsteret, velger du Øktkontroll -delen. I denne delen, under fanen med tittelen produktnavn for det mønstrede belysningsverktøyet, legger du til den lagrede sekvensen. Etter å ha lagt til sekvensen, velger du alternativet for å simulere mønsteret for å vise og justere for ønsket plassering av eksponering.MERK: Prøveplassering kan justeres her for å sikre at mønsteret projiseres nøyaktig på det målrettede området. Deretter justerer du lysintensiteten til 60 % og eksponeringstiden til 40 s under LED-kontrollfanen og starter eksponeringsprosessen. Overvåk hydrogelforringelsen i sanntids- og lysfeltmodus for å sikre celleutløsning.MERK: Unngå bevegelser i prøven under lyseksponering, da det kan føre til nedbrytning av uønskede områder av hydrogelen, noe som resulterer i krysskontaminering. 10. Henting av celler MERK: Cellegjenvinningsprosedyren er identisk for både bulkhydrgeler og mikrowellmatriser. Etter 365 nm lyseksponering og cellefrigjøring samler du cellene ved hjelp av en mikrolitersprøyte og mikrofluidisk slange (figur 2).MERK: Cellehenting må gjøres umiddelbart etter mønstereksponering. Dette gjør det mulig å gjenopprette lokaliserte celler før de frigitte cellene beveger seg bort fra det bestrålede området. Endre mikroskopet fra brightfield til FITC- eller TRITC-filter for å gjøre det mulig å visualisere det eksponerte området av prøven med det blotte øye. Når det eksponerte området er plassert, plasser enden av slangen på det bestrålede stedet. Deretter endrer du mikroskopfilteret tilbake til brightfield for å overvåke cellehenting i sanntid. Bruk sprøyten som er festet til den andre enden av slangen for å trekke forsiktig ut de frigjorte cellene. Trekk ut 200 μL av løsningen og sett løsningen inn i et 1,5 ml sentrifugerør for DNA-analyse eller plating. Figur 2: Skjematisk representasjon av utvinningsmetoden for innsamling av celler som frigjøres fra hydrogelen. Her, umiddelbart etter 365 nm UV-eksponering, hydrogelforringelse og celleutløsning, brukes mikroskopet til å belyse hydrogelprøven med lys fra et TRITC-filter, noe som resulterer i et lyst grønt sted som dekker området der celleutløsningen skjedde. Dette hjelper brukeren med å identifisere den romlige plasseringen for eksempelinnsamling. Etter visualisering av dette området plasseres oppsamlingsrør festet til en mikrolitersprøyte på dette stedet, og prøven samles inn. Brightfield mikroskopi ved 10x forstørrelse brukes til å overvåke enden av slangen og hydrogeloverflaten i sanntid for presis celleoppsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 11. Genomisk DNA-rensing og DNA-kvalitetsmåling Bruk DNA-rensesett (se Materialfortegnelse) for å trekke ut DNA fra bakterieisolasjoner. Følg produsentens spesifikasjon beskrevet i HÅNDBOKEN FOR DNA-rensesett23 frem til siste trinn (trinn 7), som krever elution med Buffer AE. For elution trinnet, følg produsentens spesifikasjon, med forskjellen ved å bruke 100 μL buffer AE i stedet for 200 μL. Gjenta elution én gang som beskrevet i trinn 11.1.2. Dette trinnet fører til økt samlet DNA-utbytte. Mål DNA-kvalitet ved hjelp av uv-vis spektrofotometer (se Materialtabell). Slå på spektrofotometeret. Etter enhetsinitialiseringen velger du dsDNA-alternativet på skjermen på hjemmesiden. Løft deretter sokkelarmen og rengjør sokkelposisjonen med DI-vann og lofrie våtservietter. Pipette 2 μL av en tom løsning, her AE buffer, på sokkelposisjonen og forsiktig bringe pidestallarmen ned og velg Blank på skjermen. Løft deretter sokkelen og rengjør sokkelposisjonen med DI-vann for å fjerne eventuelt restmateriale fra forrige måling. Legg prøven (2 μL) i sokkelposisjonen, ta ned sokkelarmen og velg Mål-knappen på skjermen. Gjør om trinn 11.2.4 og 11.2.5 for alle utvalg. Når målingen er fullført, velger du “Avslutt eksperimenter” på skjermen. Sett flash-stasjonen inn i enheten og trykk på “Eksporter data” på skjermen. 12. Bestemme celle levedyktighet fra hydrogel og mikrowell ekstrakter Fortynn bakterielle suspensjoner med en fortynningsfaktor på 105 ved hjelp av en 96-brønns plate. Pipette 10 μL av den fortynnede bakterielle suspensjonen og spot tre ganger på ATGN-plater for hver bakteriefjæring. Vipp platene for å spre cellene på agaroverflater. Lufttørk ATGN-platene som inneholder bakterielle suspensjoner. Inkuber platene ved 37 °C i 48 timer. Tell og registrer tallene for Colony Formation Units (CFUer). Tell alle tre spredningene av bakterielle suspensjoner på hver tallerken.MERK: Utfør trinn 12.1-12.4 i et biologisk sikkerhetsskap for å unngå forurensning av platen.

Representative Results

For å undersøke UV-lysets evne til å utløse kontrollert hydrogelforringelse for cellefrigjøring, ble hydrogeler først innkapslet over tiolerte deksler uten bakterier til stede. Hver hydrogel ble utsatt for tre replikeringssirkelmønstre av lys ved forskjellige intensiteter og eksponeringstider. Prosentandelen gelforringelse ble beregnet etter UV-lyseksponering ved hver lysintensitet, og eksponeringstiden ble deretter kvantifisert ved kobling av anhengstiolgrupper med fluorescein-5-maelimidfargestoff for fluorescensavbildning19,24. Et representativt eksempel på hvordan disse to parametrene påvirker hydrogelforringelse, er vist i figur 3. Som tydelig gir mønstret lys fra det mønstrede belysningsverktøyet romlig-temporal kontroll av hydrogelforringelse ved en oppløsning som kan muliggjøre frigjøring av bare et lite antall celler. Figur 3: Kontroll over hydrogelforringelse. UV-lysdose og resulterende hydrogelforringelseshastighet er justerbar via det mønstrede belysningsverktøyet. (Innsettt) To forskjellige lysintensiteter ble valgt for mønstret hydrogelforringelse. Etter 365 nm UV-lyseksponering ble hydrogeler merket med fluorescein-5-maleimid for fluorescensavbildning. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. For celleuttrekking ble forskjellige lysmønstre brukt til å undersøke cellefrigjøring (figur 4). Her ble Agrobacteriumbakterieceller innkapslet i bulkhydrgeler over tiolerte glassdeksler, og deretter dyrket i mikroskalakolonier. Hydrogeler ble deretter inspisert i brightfield mikroskopi, og målrettede mikrokolonier ble utsatt for varierte UV-lysmønstre. Det ble observert at forskjellige eksponeringsmønstre påvirket morfologien til de frigjorte cellene. Dette er potensielt gunstig for ulike applikasjoner. For eksempel resulterer det i frigjøring av hele kolonien som fortsatt er innkapslet i en beskyttende PEG-hydrogel og uten direkte UV-lyseksponering (figur 4A), som kan bevare celler og gi enkel nedstrøms rensing. Ved å eksponere deler av eller hele kolonien for UV-lys kan celler derimot trekkes ut enten som aggregerte celleklynger (figur 4B) eller som frie, individuelle celler (figur 4C). Figur 4: Kontroll over morfologien til de ekstraherte cellene. (A) Bruk av et ringmønster for å frigjøre hele cellekolonien, beskyttet i en PEG-matrise. (B) Bruk av et brutt kryssmønster for celleutløsing i aggregater. (C) Bruk av et kryssmønster for å frigjøre enkeltceller. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Kritisk i innkapslingsprotokollen er både cellefrøtettheten og tykkelsen på hydrogelen, da begge disse parametrene kan påvirke antall celler innlemmet i hydrogelen for observasjon. For å demonstrere ble A. tumefaciens celleprøver innkapslet i hydrogeler av to forskjellige tykkelser ved hjelp av tynne avstandsstykker (12,7 μm) eller tykke avstandsstykker (40 μm) dyrket, og avbildet etter de etablerte protokollene. Tynnere hydrogeler resulterte i en mikrokolonitetthet på 90 kolonier/mm2 i hele hydrogelen, der det ble observert minimal kolonioverlapping (figur 5A). I motsetning til dette resulterte hydrogeltykkelser større enn 12,7 μm i dannelsen av overlappende kolonier i vertikal retning (figur 5B), noe som kan føre til utvinning av flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsake krysskontaminering under ekstraksjon på grunn av lysmønsterets todimensjonale natur. For eksempel kan en toppkoloni målrettes, mens en underliggende koloni også ekstraheres med den (Figur 5C). Derfor anbefales bruk av 12,7 μm avstandsstykker for hydrogelpreparat. Figur 5: Hydrogeltykkelse påvirker ekstraksjonsrenheten. (A) Ved å bruke avstandsstykker med en tykkelse på 12,7 μm for hydrogeldannelse, dannes kolonier innenfor ett 10x fokalplan. (B) Overlegg av kolonier kan observeres ved 10x forstørrelse hvis avstandsstykker med større tykkelser enn 12,7 μm brukes. (C) Krysskontaminering kan oppstå med et overlegg av kolonier under celleutløsning: (i) et ringmønster brukes til å frigjøre en målrettet cellekoloni, (ii) den målrettede cellekolonien løsnes fra hydrogelen, og (iii) en andre underliggende koloni observeres under lyseksponeringen under den målrettede kolonien. Denne kolonien er også fjernet, noe som resulterer i krysskontaminering. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Gitt den potensielle skaden på bakterier med UV-lys, ble effekten av varierte UV-lysmikropatterner på celle levedyktighet videre studert ved hjelp av modell, Gram-positive bakterier (B. subtilis) og modell, Gram-negative bakterier (E. coli). Hver av dem ble innkapslet i bulkhydrgeler og dyrket i mikroskalakolonier i henhold til standardprotokoller, og bekreftet deres kompatibilitet med hydrogelen. Målrettede mikrokolonier av tilsvarende størrelse (26 ± 1 μm diameter) ble deretter utsatt for en konstant lysdose (168 mJ/mm2), enten i form av sirkelmønstre som utsetter hele mikrokolonier for UV-lys eller kryssmønstre som bare forringer hydrogelkanter for å minimere lyseksponering for celler. Celler ble deretter gjenvunnet og belagt for å kvantifisere CFU / ml gjenvunnet fra hver koloni. Fant ingen signifikant forskjell i cellegjenopprettingsnivå (figur 6A). For å undersøke renheten til de ekstraherte cellene ytterligere, ble DNA hentet fra E. coli-prøver og analysert ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer. For begge mønstrene faller DNA-kvalitetsnivåene innenfor et A260/A280-område mellom 1,8 og 2,0 (figur 6B), som er i det ideelle området for genomisk sekvensering25. Dette viser at UV-mønstrene som brukes til frigjøring under de beskrevne forholdene har minimal effekt på mengden levedyktige celler som utvinnes fra bulkhydrgelene eller på genomisk DNA-kvalitet etter utvinning. Figur 6: Påvirkning av ulike lyseksponeringsmønstre på celle levedyktighet og DNA-kvalitet på bakterier frigjort fra bulk hydrogeler. (A) Cellegjenvinningsnivåer for både E. coli og B. subtilis etter utvinning ved hjelp av kryssmønstre og sirkelmønstre. For dette eksperimentet ble utvinning gjort fra sfæriske kolonier med samme diameter (26 μm ± 1 μm) for å sikre at antall frigjorte celler fra hver koloni var ekvivalent. De ekstraherte løsningene ble deretter belagt for å beregne CFU/ml som er anskaffet fra hvert mønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskjell i CFU/ml hentet fra kryss- og sirkelmønstre for både E. coli og B. subtilis (P-verdi > 0,05, n= 6 for begge stammene). (B) Spektrofotometrisk kvantifisering av DNA-kvalitet for isolerte E. coli-celler ved hjelp av kryss- og sirkelmønstre. Her viste statistisk analyse ikke en signifikant forskjell i DNA-kvalitet for mønstrene som brukes (P-verdi > 0,05, n = 6) (C) Brightfield-bilder av kolonier med like diametre utsatt for kryss- og sirkelmønstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Microwell-rekker gir et alternativt, lab-on-a-chip screening-grensesnitt som tilbyr mer kontrollerte screeningfunksjoner sammenlignet med bulkhydrgeler. For eksempel muliggjør mikrowellmatriser såing av bakterier til diskrete kultursteder der antall celler i inoculum kan kontrolleres. Geometriske egenskaper av mikrowells som brønndybde og diameter styres også gjennom standard mikrofabrikasjonsmetoder. Med disse fordelene har mikrowells vært nyttige for å studere bakterievekst under romlig innesperring26, og senest for oppdagelsen av symbiotiske og antagonistiske interaksjoner mellom forskjellige bakteriearter når de er begrenset sammen ved mikroskala18. Cellulær utvinning fra brønner for genomisk analyse som 16S amplicon sekvensering er avgjørende for disse bruksområdene. Ved hjelp av samme hydrogelmateriale kan UV-lys eksponeres over en brønn som inneholder celler av interesse, enten som sirkel- eller ringmønstre. Sistnevnte sikrer hydrogelforringelse bare ved mikrowell-omkretsen for å forhindre direkte bestråling av celler. For å demonstrere dette ble A. tumefaciens celler som uttrykker mCherry sådd inn i brønner, hydrogelen ble deretter festet til mikrowell-matrisen. Celler ble dyrket og deretter bestrålet med enten sirkel- eller ringmønstre. Membranen ble deretter farget med fluorescein-5-maleimidfargestoff. Tofargers fluorescensbilder viste at både membranen og cellene i brønnene fjernes for begge bestrålingsmønstrene17. I motsetning til bulk hydrogelformatet har celleutvinning her bare blitt observert i form av celleklynger18. Figur 7: Representative konfiskeringsmikroskopibilder som viser lysmønsterpåvirkning på celleisolasjon fra mikrowellmatriser. (A) Mikrowells med diameter på 40 μm som inneholder bakterier (rød) etter sådd og kultur. (B) Lyseksponering ved hjelp av sirkel- og ringemønstre (blå). (C) Redusert rød fluorescens viser at celler ekstraheres fra bestrålede brønner. (D) Tofarget fluorescensbilde av membraner og bakterier etter bestråling, noe som indikerer fjerning av både hydrogel (grønn) og bakterier (rød) fra målbrønner. (E) Z-stack, tofarget fluorescensbilde av målbrønner. Den røde linjen i (D) angir xz-planet som er avbildet i (E), og den grønne linjen i (E) angir xy-planet som er avbildet i (D). Eksempler på bilder (C-E) ble vasket for fjerning av frigitte celler, deretter fast og avbildet. Skalastang = 40 μm. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra van der Vlies et al.17. Copyright 2019 Amerikansk kjemisk soceity. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. For å kvantifisere bakterier celle levedyktighet og DNA-kvalitet etter utvinning i dette formatet, B. subtilis og E. coli celler ble sådd, dyrket, og deretter frigjort fra microwell arrays ved hjelp av sirkel og ring mønstre (Figur 8A, B). Frigjorte celler ble deretter belagt på ATGN agarplater, og DNA-kvaliteten på de ekstraherte cellene ble kvantifisert. For å sikre at et konsekvent antall celler var til stede under hver ekstraksjon, ble mikrowells med lignende fluorescerende intensiteter (~ 6000 a.U.) og derfor et lignende antall celler målrettet for frigjøring. Antall levedyktige celler som ble trukket ut ved hjelp av et sirkelmønster, var ikke signifikant forskjellig fra antall levedyktige celler som ble ekstrahert ved hjelp av ringmønster for begge bakteriene (Figur 8C). DNA-kvalitetsnivåene var heller ikke signifikant forskjellige mellom sirkel- og ringmønstrene for noen av bakteriene (Figur 8D). Derfor, i likhet med funn i bulkhydrgeler, hadde anvendelsen av UV-lys med den intensiteten og varigheten som er angitt her, en ubetydelig innvirkning på levedyktigheten og DNA-kvaliteten på celler hentet fra mikrowellmatrisene. Disse funnene viser at levedyktige bakterieceller selektivt kan hentes fra mikrowells med minimal skade for nedstrømsanalyse. Figur 8: Påvirkning av ulike lyseksponeringsmønstre på celle levedyktighet og DNA-kvalitet på bakterier frigjort fra mikrowell arrays. (A,B) For både E. coli og B. subtilisble sirkelmønstre og ringmønstre brukt til celleutvinning fra 10 μm mikrowells. Sirkelmønster med en diameter på 10 μm og ringmønster med en indre diameter på 10 μm og ytre diameter på 20 μm ble brukt i dette eksperimentet for celleutvinning. Mikrowells med samme diameter ble brukt for å sikre at antall frigjorte celler fra hver mikrowell var det samme. (C) De ekstraherte løsningene ble deretter belagt for å beregne CFU/ml fra hvert eksponeringsmønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskjell i CFU/ml hentet fra sirkel- og ringmønster for både E. coli og B. subtilis (P-verdi > 0,05, n = 6 for begge stammene). (D) Spektrofotometri ble brukt til å måle DNA-kvaliteten til både E. coli og B. subtilis celler ved hjelp av sirkel- og ringmønstre. Her viste statistisk analyse ingen signifikant forskjell i DNA-kvaliteten for mønstrene som ble brukt (P-verdi > 0,05, n = 6 for begge stammene). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Supplerende figur 1: Design og fabrikasjon av mikrowellmatriser. (A) Standard mikrofabrikasjonsteknikker ble brukt til å fremstille mikrowellmatriser på silisiumskiver. (B) Hvert underlag besto av 7 x 7 arrayer med 10μm diameter brønner med 20 μm dybde og 30 μm pitch. (C) Hver matrise besto av 225 mikrowells. Denne figuren er endret fra Barua et al.18. Opphavsrett 2021 Frontiers Media. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Dette manuskriptet demonstrerer bruk av foto nedbrytbare hydrogeler for bakteriescreening og isolasjon. Materialet og tilnærmingen muliggjør høy gjennomstrømningskultur, kontroll over vekstmedier og vekstforhold, og ren og presis celleutvinning på en enkel og kostnadseffektiv måte. Ekstraksjon krever bare et fluorescerende mikroskop kombinert med det mønstrede belysningsverktøyet og kan gjøres på en sekvensiell måte for å isolere flere cellemål. Hver utvinning tar 5-10 min å utføre, og opptil 30 målrettede kolonier er fjernet fra en enkelt hydrogel. En viktig fordel med tilnærmingen er tilpasningsevnen til en rekke forskjellige analyseformater, som vist her med screening fra både bulk hydrogeler og mikrowell arrays. Separasjonsprosessen i begge formatene har blitt brukt til å isolere bakterier som viser unik vekstatferd for nedstrøms genotyping etter kultur og mikroskopisk observasjon, en kritisk evne til å koble cellegenotype til fenotype. Til dags dato har genomiske karakteriseringer av bakterier hentet fra disse grensesnittene inkludert 16S ampliconsekvensering for å identifisere flerartssamlinger av bakterier fra miljømikrobiomer som genererer fremvoksende vekstatferd¹⁸, og for helgenomsekvensering for å identifisere genetiske mutasjoner som forårsaker sjeldne vekstprofiler i celler som er tilstede i mutante biblioteker¹⁹.

Å bruke bulk hydrogeler for cellescreening og isolasjon er det mest enkle og enkle formatet. Bulk foto nedbrytbare hydrogeler dannes raskt (25 min) etter blanding av forløperne over gjennomsiktige glassdeksler for å innkapsle celler i en 3D-cellekulturmatrise som er avbildet med et standard oppreist eller invertert fluorescensmikroskop. Metoden har dermed potensial til å være translasjonell til vanlige mikrobiologiske laboratorier som ikke har mikrofabrikasjonsressurser eller kompetanse. En ulempe med dette formatet er at cellene er tilfeldig orientert gjennom den tredimensjonale hydrogelen. Derfor kan celler vises ut av fokusplanet når avbildning med høyere forstørrelsesmål og ekstraksjon kan være vanskelig hvis cellekolonier er orientert for nær hverandre, eller hvis det er et vertikalt overlegg av kolonier. Deponering av en tynn hydrogel (<13 μm) som beskrevet er avgjørende for å redusere denne ulempen. Eksponering i ødelagte krysslysmønstre (Figur 4B) er å foretrekke her, da dette mønsteret resulterer i celler fri for hydrogelen som har minimal eksponering for UV-lys og lett kan gjenvinnes gjennom plating.

I motsetning gir microwell-matriseformatet et mer godt kontrollert grensesnitt, da bakterieceller er partisjonert i diskrete mikrowells som tjener som små kultur- eller samkultursteder^17,18,26. Microwell-dimensjon, tonehøyde og tetthet fremstilles nøyaktig ved hjelp av standard fotolittografiske teknikker. Sammenlignet med bulk hydrogeler, kan bakterier ekstraheres fra mikrowell arrayer med høyere grad av spesifisitet og lavere sjanse for krysskontaminering, da cellene bare er til stede på forhåndsdefinerte steder, ikke tilfeldig spredt over hele hydrogelen. Konsentrasjonen og forholdet mellom bakterieceller i såingsløsningen kan også varieres for å kontrollere mengden og sammensetningen av mikrowell inoculum gjennom en såingsprosess som har blitt karakterisert i tidligere rapporter²⁶, noe som gir brukeren fleksibilitet i skjermens eksperimentelle design. Den primære ulempen ved screening med microwell array-formatet er den ekstra tiden og ekspertisen som kreves for mikrofabrikasjon. Fabrikasjon av mikrowells ble estimert til å koste ~ $ 10 per matrise, som inkluderer materialkostnader og renromsutgifter. I tillegg er mikrowells matriser tradisjonelt laget av silisium, noe som kan forårsake avbildningsvansker siden substratene ikke er gjennomsiktige. Videre kan en høy mengde lysspredning fra silisiumoverflaten begrense bildebehandlingen i mikrowells og kan redusere mønsteroppløsningen under hydrogeleksponering med UV-lys fra det mønstrede belysningsverktøyet (sett i figur 8A,B). Lignende mikrowells har blitt fremstilt på gjennomsiktige kvartssubstrater for å adressere denne typen begrensninger²⁷; Denne fabrikasjonen er imidlertid betydelig vanskeligere. Eksponering for ringmønstre som lyser opp omkretsen av brønnen, er å foretrekke her for å frigjøre friplasser fra brønnene samtidig som UV-eksponering minimeres.

Det vanligste problemet som oppstår i begge format er løsrivelse av hydrogelen fra det underliggende substratet under kultur på grunn av hydrogel hevelse. Hvis dette er et problem for bulkhydrgeler, bør tilstedeværelsen, tettheten og ensartetheten til tiolgrupper i det kjemiske (MTPS) festelaget over overflaten av glassdekslene verifiseres ved hjelp av en passende overflatekarakteriseringsteknikk (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Lave tettheter av overflatetiolgrupper på grunn av ineffektiv overflatefunksjonalisering kan føre til en svak interaksjon mellom substratet og hydrogelen. Hvis det oppstår et lavt nivå av overflatetiolasjon, bør stabiliteten til MTPS-løsningen kontrolleres. Det må utvises forsiktighet ved første rengjøring av glasssklie for å sikre en ren overflate før MTPS-behandling, og det må utvises forsiktighet for å sikre bruk av vannfri toluen under MTPS overflatereaksjon (protokoll avsnitt 4). Når det gjelder mikrowellmatriser, blir overflater ikke thiolated, og hydrogeler festes i stedet gjennom delvis fylling av brønnene med hydrogelen, som forankrer hydrogelen til silisiumsubstratet¹⁷. Hvis hydrogelavløsning er et problem i dette systemet, kan flere mikrowells eller andre mikroskalafunksjoner etses inn i matrisen for ytterligere å forankre hydrogelen til substratet for å fremme sterkere vedlegg.

En begrensning av teknikken i begge formatene er hydrogelenes begrensede stabilitet i nærvær av bakterier. Det har blitt bemerket at noen bakterier, som A. tumefaciens, kan forringe hydrogelen i løpet av 5-7 dager^17,19, noe som begrenser eksperimenttiden. Nåværende undersøkelse av mekanismene for bakteriell nedbrytning er i gang; Det er hypoteset at estergruppene som er tilstede fra diakrylatmonomene, er utsatt for bakteriemediert hydrolyse og/eller enzymatisk nedbrytning, som nevnt i andre systemer¹⁷. Å utvikle mer stabile hydrogelkjemier vil forlenge tiden bakterier kan forbli i hydrogelen og vil utvide skjermen til mikroorganismer med lavere vekstrater. En annen begrensning er at i begge formater forekommer cellegjenoppretting og ekstraksjon i et åpent miljø, noe som resulterer i relativt høye ekstraksjonsvolumer (30-100 μL), som kan være utsatt for forurensning utenfra. Dermed må det tas hensyn til at nok celler er til stede fra målkoloniene samtidig som ekstraksjonsløsningsvolumet minimeres. For å oppnå nok celler til plating og utvinning eller for utvinning av DNA-materiale, ble det observert at i bulk hydrogeler må celler dyrkes lenge nok til å nå kolonidiametre på minst 10 μm. For å senke det nødvendige volumet for celleutvinning ble det observert at bruk av en mikrolitersprøyte og rør (figur 2) var mer effektivt enn pipettering. Slangen gjorde det mulig å trekke isolasjonene mer nøyaktig fra utløserpunktet, noe som krevde mindre løsningsvolum og reduserte sjansen for forurensning.

Fremtidig arbeid innebærer å forstå effekten av hydrogel mekaniske egenskaper på cellevekst, da mekaniske egenskaper ved disse hydrogelene er godt kontrollert av valg av passende PEG-baserte monomerforløpere av ulike molekylvekter²⁸, og mekaniske interaksjoner spiller sannsynligvis en viktig rolle i bakterieadferd²⁹. Siden hydrogelmaterialene lett kan innlemmes i en rekke forskjellige systemer og enheter, er videreutvikling også fokusert på integrering av dette materialet i mikrofluidiske systemer. Dette vil redusere utvinningsløsningen til femtoliter til picoliter-volumer, sammenlignet med tradisjonelle 30-100 μL volumer som for tiden kreves i det åpne samlingsformatet. Mindre løsningsvolumer vil i stor grad redusere potensiell forurensning og flytte tilnærmingen til encellet isolasjon og karakterisering.

Materials

(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detergent powder	Alconox	1104
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A702-500	Certified ACS Granular
Autoclave SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Brightfield upright microscope	Olympus Corporation	BX51
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Chemical	C614-500	For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reagent, > 99.0%
D-Glucose (Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA purification kit
DOWSIL 184 silicone elastomer base	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: -30-60 °C
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: < 32 C
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Ethanol, anhydrous	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand microscope cover glass	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest premium microscope slides plain	Fisher Scientific	12-544-4
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contains inhibitor, 30 wt% in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Magnesium sulfate, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reagent, > 99.8%
NanoDrop One spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Nitrogen, compressed	Matheson	UN1066
Oxygen plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Store between 15 °C–30 °C
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Sodium chloride	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagent, suitable for cell culture
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T)
Stainless steel thickness gage	Precision Brand Products	77739
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluene, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anhydrous, > 99.8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092-500G	For microbiology
Ultrasonic sonicator	Fischer Scientific	FS-110H