Miniscope in vivo calcium imaging er en kraftfuld teknik til at studere neuronal dynamik og mikrokredsløb i frit opførende mus. Denne protokol beskriver udførelse af hjerneoperationer for at opnå god in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et mikroskop.
Et miniaturefluorescensmikroskop (miniskop) er et potent værktøj til in vivo calciumbilleddannelse fra frit opførende dyr. Det giver flere fordele i forhold til konventionelle multi-foton calciumbilleddannelsessystemer: (1) kompakt; 2) letvægtet 3) økonomisk overkommelige og (4) tillader optagelse fra frit opførende dyr. Denne protokol beskriver hjerneoperationer for dyb hjerne in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Forberedelsesproceduren består af tre trin, herunder (1) stereotaksisk injektion af virussen i det ønskede hjerneområde i en musehjerne for at mærke en bestemt undergruppe af neuroner med genetisk kodet calciumsensor; (2) implantation af gradientindekslinse (GRIN), der kan videresende calciumbillede fra dyb hjerneregion til mikroskopsystemet og (3) anbringelse af mikroskopholderen over musekraniet, hvor miniskopet kan fastgøres senere. For at udføre in vivo calciumbilleddannelse fastgøres mikroskopet på holderen, og neuronale calciumbilleder indsamles sammen med samtidige adfærdsoptagelser. Den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse .
Intracellulær Ca2+ signalering er en væsentlig regulator af cellevækst, proliferation, differentiering, migration, gentranskription, sekretion og apoptose1. I neuroner styres Ca2+ signalering præcist, da dets rumlige-tidsmæssige mønster er relateret til afgørende funktioner såsom membranexcitabilitet, neurotransmitterfrigivelse og synaptisk plasticitet2.
In vivo calciumbilleddannelse er en kraftfuld teknik, der kan bruges til at afkode neurale kredsløbsrepræsentation elementær til normal dyreadfærd, identificere afvigende neuronale aktiviteter i dyremodeller af hjernesygdomme og optrævle potentielle terapeutiske mål, der kan normalisere disse ændrede kredsløb. De to almindelige in vivo calciumbilleddannelsessystemer er to-foton laser scanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hovedmonteret miniaturiseret mikroskopi (miniscope)7,8,9,10,11,12,13 . Den konventionelle to-fotonmikroskopi giver kommanderende fordele såsom bedre opløsning, lavere støj og lavere fotobleaching; Forsøgsdyrene skal dog være hovedfaste, hvilket begrænser de adfærdsundersøgelser, der kan udføres 3,4,5,6. I modsætning hertil er det hovedmonterede miniscope-system lille og bærbart, hvilket gør det muligt at studere en lang række adfærdstest ved hjælp af frit opførende dyr 7,8,9,10,11,12,13.
Der er to førende Ca2+ indikatorer, kemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede calciumindikatorer (GEKI’er)15,16. Ca2+ billeddannelse er blevet lettet ved hjælp af meget følsomme GEKI’er leveret med virale vektorer, der tillader specifik mærkning af neuroner i det målrettede kredsløb. Den kontinuerlige indsats for at forbedre følsomheden, levetiden og evnen til at mærke selv de subcellulære rum gør GECI’er ideelle til forskellige in vivo calciumbilleddannelsesundersøgelser 17,18,19.
Spredningen af lys i hjernevæv under billeddannelse begrænser den optiske penetration i dybden, selv med to-fotonmikroskopien. Gradient Index (GRIN) linsen overvinder imidlertid dette problem, da GRIN-linsen kan indlejres direkte i det biologiske væv og videresende billeder fra det dybe hjerneområde til mikroskopmålet. I modsætning til konventionelle objektiver lavet af optisk homogent materiale og kræver en kompliceret formet overflade for at fokusere og skabe billeder, er GRIN-objektivets ydeevne baseret på en gradvis brydningsindeksændring i objektivmaterialet, der opnår fokus med en plan overflade20. GRIN-objektivet kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniaturiseret GRIN-linse implanteres i den dybe hjerne uden at forårsage for meget skade.
I denne artikel præsenteres en komplet kirurgisk protokol for den dybe hjerne in vivo calciumbilleddannelse. Til demonstrationsformålet beskriver vi hjerneoperationer specifikt rettet mod den mediale præfrontale cortex (mPFC) i musehjernen og in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse via et specialbygget mikroskopsystem udviklet af Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle procedure involverer to store hjerneoperationer. Den første operation er stereotaxisk injektion af en viral vektor, der udtrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den anden operation er at implantere GRIN-linsen i det samme hjerneområde. Efter genopretning fra disse hjerneoperationer er den efterfølgende procedure at anbringe mikroskopholderen (basen) på musekraniet ved hjælp af tandcement. In vivo Ca2+ billeddannelse kan udføres når som helst efter montering af miniscope på dets base. Operationsprotokollen til viral injektion og GRIN-linseimplantation er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og tofotonbilleddannelsessystemer til den dybe hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.
Et centralt spørgsmål i neurovidenskab er at forstå, hvordan neurale dynamikker og kredsløb koder og lagrer information, og hvordan de ændres i hjernesygdomme. Ved hjælp af et miniskop in vivo Ca2+ billeddannelsessystem kan individuel neural aktivitet fra flere hundrede neuroner i et lokalt mikrokredsløb overvåges samtidigt fra et frit opførende dyr. Her beskrives en detaljeret operationsprotokol for viral injektion og IMPLANTATION AF GRIN-linser for at forberede gnavere til en dyb hjerne in vivo Ca2+ billeddannelse via et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Tabel 1 viser sammenligningerne af vores miniscope-system med andre kommercielt tilgængelige og specialbyggede miniscope-systemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er værd at bemærke, at GRIN-linseimplantation ved hjælp af den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med enhver kommerciel eller specialbygget enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til en dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.
Fra viral injektion til dataindsamling af mikroskop in vivo calciumbilleddannelse tager hele den eksperimentelle procedure mindst 2 måneder at gennemføre. Det er en kompliceret og arbejdskrævende proces. Eksperimentets endelige succes afhænger af flere faktorer, herunder korrekt valg af GECIS’er, injektion af virus nøjagtigt i det målrettede hjerneområde, tilstrækkelig viral ekspression i den ønskede neurale population, implantation af GRIN-linsen præcist på det ønskede sted, tilstrækkelig genopretning fra operationer, samt om alvorlig betændelse opstår efter operationen, og om dyrets adfærd er alvorligt påvirket af operationer, og så videre.
To kritiske trin omfatter stereotaksisk injektion af virus og GRIN-linseimplantation. Til demonstrationsformålet blev den stereotaksiske mikroinjektion udført i musens mPFC, hvor adeno-associeret virus (AAV1) koder GCaMP6f under kontrol af CaMKII-promotor, der selektivt mærker pyramidale neuroner i mPFC. GCaMP6f blev valgt, da det er en af de hurtigste og mest følsomme calciumindikatorer med en halv henfaldstid på 71 ms15. Derudover er AAV viral ekspression af GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), hvilket gør den ideel til at udføre gentagen in vivo Ca2+ billeddannelse over en lang periode til langsgående undersøgelser i musemodeller af neurodegenerative sygdomme27. Den nuværende kirurgiske protokol kan tilpasses til at målrette mod forskellige cellepopulationer i enhver anden hjerneregion. Forskellige tilgængelige virale værktøjer tillader selektiv mærkning af specifikke neurale populationer i den ønskede hjerneregion i den ønskede alder. Derudover kan forskere drage fordel af Cre-LoxP-rekombinationssystemet og forskellige tilgængelige transgene musemodeller til at udføre genetiske modifikationer og studere det adfærdsmæssige og neurale kredsløbsresultat28,29.
Et unikt træk ved den præsenterede protokol er, at den automatiserede lag-for-lag hjernevævsaspiration blev udført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantation. Dette opnås gennem en 27 G-nål, der er forbundet til et vakuumsystem, styret af en specialbygget robotarm og software23. Baseret på vores erfaring genererer denne metode en ensartet overflade, som GRIN-linsen kan komme i kontakt med, og forårsager mindre skade på nabovævet end manuel vævsaspiration23. Af denne grund giver denne procedure en åbenlys fordel for GRIN-objektiver med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vævsaspiration er dog muligvis ikke nødvendig for implantering af et GRIN-objektiv med en mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det førende spor lavet med en 30 G nål21.
Udover de to kritiske trin, der er diskuteret ovenfor, skal mange andre faktorer overvejes nøje for en vellykket operation. (1) Alle de instrumenter, der kommer i kontakt med hjernen, skal steriliseres for at forhindre infektion. (2) Alle kirurgiske trin skal udføres for at minimere skader på hjernen for at forhindre yderligere betændelse og overdreven dannelse af arvæv. (3) De anæstesidoser, der gives oprindeligt og vedligeholdes under operationen, især dem, der administreres intraperitonealt, skal overvejes nøje. Anæstesidoserne kan ændres i henhold til forskellige musestammer, da nogle kan være mere modtagelige. (4) Musens tilstand skal konstant overvåges under operationen. Endelig (5) musene skal overvåges regelmæssigt efter operationen, da der kan opstå mange komplikationer efter operationen.
Selvom en del af hjernevævet fjernes ensidigt under GRIN-linseimplantationstrinnet, observerede vi ikke nogen åbenlyse adfærdsunderskud 7,12. Vægten af miniscope er omkring 2 gram, og kablet er specialdesignet til at gøre det let og sikre, at musen let kan bære det. Miniskopet og kablet er kun fastgjort til dyret før in vivo-billeddannelse og løsnes efter billeddannelse. Hele billeddannelsesprocessen tager normalt ikke længere end 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringer ikke musen i frit at opføre sig. Miniscope-installations- og afinstallationstrinnene har brug for en kort anæstesi (mindre end 2 minutter) med isofluran med henblik på dyrebegrænsning. Vi lader typisk musen komme sig efter den korte eksponering af isofluran i 30 minutter, før vi udfører in vivo-billeddannelse. Vi har udført miniscope in vivo calcium imaging en gang om ugen i et par uger uden at bemærke nogen indvirkning på musens sundhed og musens sociale adfærd12.
En væsentlig begrænsning i det nuværende miniscope-optagelsessystem er behovet for at forbinde mikroskopet til et kabel til dataindsamling. Tilstedeværelsen af kablet begrænser undertiden musens opgaveudførelse og begrænser optagelsen af et dyr ad gangen. For nylig er der udviklet et trådløst miniskop25,26. Dette vil udvide opgaveudførelsen og muliggøre samtidig in vivo-billeddannelse fra flere dyr i en gruppe. Desuden vil udvikling af mere følsomme GECIS’er med spektralt adskillelige bølgelængder kombineret med et dobbeltfarvet mikroskop give mere spændende muligheder for neurovidenskabelig forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.
0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |