Screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae resistentie
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de efficiënte en nauwkeurige screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae-resistentie bij zaailingen. Dit is een praktische benadering voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.
Abstract
Zwarte schacht, veroorzaakt door de oomyceten Phytophthora nicotianae, is destructief voor tabak en deze ziekteverwekker is hoogpathogeen voor veel solanaceous gewassen. P. nicotianae is goed aangepast aan hoge temperaturen; daarom wint onderzoek naar deze ziekteverwekker wereldwijd aan belang in de landbouw vanwege de opwarming van de aarde. P. nicotianae-resistente variëteiten van tabaksplanten worden vaak gescreend door inenting met haverkorrels gekoloniseerd door P. nicotianae en controle op de ziektesymptomen. Het is echter moeilijk om de inentingsintensiteit te kwantificeren, omdat nauwkeurige inenting in dit geval cruciaal is. Deze studie had tot doel een efficiënte en betrouwbare methode te ontwikkelen voor het evalueren van de resistentie van tabak tegen infectie met P. nicotianae. Deze methode is met succes gebruikt om resistente variëteiten te identificeren en de inentingsefficiëntie werd bevestigd door real-time PCR. De resistentie-evaluatiemethode die in deze studie wordt gepresenteerd, is efficiënt en praktisch voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.
Introduction
P. nicotianae is destructief voor veel solanaceous gewassen. Het kan tabak “zwarte schacht”1, aardappelblad en knolrot2, tomaat en paprika kroon en wortelrot3, en Goji kraag en wortelrot4 veroorzaken. P. nicotianae kan alle delen van tabaksplanten aanvallen, inclusief de wortels, stengels en bladeren in elk groeistadium5. Het meest voorkomende symptoom van de ziekte is de zwarte basis van de stengel. De wortels zijn aanvankelijk zichtbaar als met water doordrenkt en worden vervolgens necrotisch en de bladeren vertonen grote cirkelvormige laesies5. Deze ziekte kan verwoestend zijn voor een tabaksplant in de kas, maar ook in het veld6. De meest praktische en economische methode voor het beheersen van P. nicotianae is het gebruik van resistente variëteiten7. Er is echter een effectief screeningsprotocol vereist voor de identificatie van P. nicotianae-resistente toetredingen uit tabakskiemplasmacollecties.
Er zijn verschillende identificatiemethoden beschreven om de resistentie van P. nicotianae in tabak te beoordelen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Over het algemeen zijn drie belangrijke benaderingen gebruikt voor de identificatie van P. nicotianae-resistente tabaksgenotypes. De eerste omvat het mengen van mycelia met agar medium op petriplaten met P. nicotianae. De mycelia worden vervolgens gedurende 2 weken in het donker bij kamertemperatuur gekweekt. 1 L gedeïoniseerd water wordt toegevoegd aan de mycelia en gehomogeniseerd gedurende 30 s. Het entmateriaal wordt op ijs gehouden tot het nodig is. Twee gaten (1 cm in diameter en 4-5 cm diep) worden aan elke kant van de plant gemaakt en 10 ml van het entmateriaal wordt in elk gat gegoten. De gaten worden vervolgens opgevuld met de omringende grond en de ontwikkeling van ziekten wordt dagelijks gedurende 2 weken gemonitord8,10.
Bij de tweede methode worden de planten ingeënt met met ziekteverwekkers besmette tandenstokers. Voor deze aanpak moeten de planten ongeveer 6 weken na het verplanten worden gebruikt en een minimale hoogte van 30 cm hebben. Geautoclaveerde tandenstokers worden geplaatst op het oppervlak van culturen die P. nicotianae mycelia bevatten. De kweekschotels worden vervolgens 7 dagen onder het licht bij kamertemperatuur bewaard. Vervolgens worden gekoloniseerde tandenstokers gebruikt om de planten te enten. Tandenstokers worden in de tabaksstengels tussen de vierde en vijfde knop ingebracht. De planten worden dagelijks gedurende 5 dagen gemonitord9,15. Deze methode is niet van toepassing op kleine zaailingen. Omdat het entmateriaal met ziekteverwekkers besmet is, kan de intensiteit van de inenting niet nauwkeurig worden gecontroleerd.
De meest gebruikte aanpak omvat haverkorrels voor inenting. In dit geval worden haverkorrels bereid door 500 ml haver en 300 ml gedeïoniseerd water bij 121 ° C gedurende 1 uur eenmaal daags gedurende 3 dagen te autoclaveren. Vervolgens worden haverkorrels toegevoegd aan het pathogeen-gekoloniseerde kweekmedium. De gerechten worden afgesloten met paraffinefilm en geïncubeerd bij 25 °C in licht gedurende 7-12 dagen. Vier afzonderlijke 5 cm diepe gaten worden gemaaktop de potgrond, 4 cm van elke plant, en één met ziekteverwekkers aangetaste haverkorrel wordt in elk gat geplaatst. De incubatietijd wordt bepaald op basis van wanneer het eerste bovengrondse symptoom optreedt7,11,12,13,14,15,16. Deze methode is efficiënt en toepasbaar voor grootschalige weerstandsscreening. Een beperking van deze benadering is echter dat het entmateriaal pathogene aangetaste haverkorrels zijn, waardoor de inentingsintensiteit niet precies kan worden gecontroleerd.
Hier wordt echter een nauwkeurigere methode gepresenteerd die van toepassing is op de evaluatie van de groeikamerweerstand. In vergelijking met de andere benaderingen is het entmateriaal zoospore-suspensie, vandaar dat de inentingsintensiteit controleerbaar en instelbaar is. Omdat de tabaksplanten in deze studie zonder grond worden gekweekt, zijn de resultaten gemakkelijker waar te nemen. Bovendien veroorzaakt het bemonsteren van plantenwortels uit de grond altijd schade aan de wortels, wat een reeks fysiologische reacties veroorzaakt17. Bij deze methode, omdat planten zonder grond worden gekweekt, kan de interferentie in wortelschade worden geëlimineerd. Kortom, deze methode is praktischer voor moleculair mechanismeonderzoek en precisieveredeling. Met behulp van dit protocol worden gegevens meestal binnen 5 dagen verkregen, met meer dan 200 planten geëvalueerd in een enkel experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meerdere resistentiebronnen zijn gebruikt om de P. nicotianae-resistentie in gekweekte tabak te verbeteren. Enkele dominante R-genen, Php en Phl, zijn introgressed van respectievelijk Nicotiana plumbaginifolia en Nicotiana longiflora10. De sigarentabakvariëteit Beinhart 1000 heeft het hoogste gerapporteerde niveau van kwantitatieve resistentie tegen P. nicotianae13. Meerdere interval mapping experimenten hebben gesugger…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31571738) en het Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco ‘Beinhart 1000’ × ‘Hicks’ mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
