Screening von Tabakgenotypen auf Phytophthora nicotianae-Resistenz
Summary
Hier wird ein Protokoll für das effiziente und genaue Screening von Tabakgenotypen auf Phytophthora nicotianae-Resistenz in Sämlingen vorgestellt. Dies ist ein praktischer Ansatz für die Präzisionszüchtung sowie die Erforschung molekularer Mechanismen.
Abstract
Schwarzer Schaft, verursacht durch die Oomycetes Phytophthora nicotianae, ist zerstörerisch für Tabak, und dieser Erreger ist für viele Nachtschattengewächse hoch pathogen. P. nicotianae ist gut an hohe Temperaturen angepasst; Daher gewinnt die Erforschung dieses Erregers in der Landwirtschaft weltweit aufgrund der globalen Erwärmung an Bedeutung. P. nicotianae-resistente Sorten von Tabakpflanzen werden üblicherweise durch Beimpfung mit Haferkörnern, die von P. nicotianae besiedelt sind, und Überwachung auf die Krankheitssymptome untersucht. Es ist jedoch schwierig, die Impfintensität zu quantifizieren, da in diesem Fall eine genaue Impfung entscheidend ist. Diese Studie zielte darauf ab, eine effiziente und zuverlässige Methode zur Bewertung der Resistenz von Tabak gegen eine Infektion mit P. nicotianae zu entwickeln. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung resistenter Sorten eingesetzt, und die Impfeffizienz wurde durch die real-time PCR bestätigt. Die in dieser Studie vorgestellte Methode zur Bewertung der Resistenz ist effizient und praktisch für die Präzisionszüchtung sowie die Erforschung molekularer Mechanismen.
Introduction
P. nicotianae ist zerstörerisch für viele Nachtschattengewächse. Es kann Tabak “schwarzer Schaft“1, Kartoffelblatt und Knollenrot2, Tomaten– und Paprikakrone und Wurzelfäule3 und Goji-Kragen und Wurzelrot4 verursachen. P. nicotianae kann alle Teile von Tabakpflanzen angreifen, einschließlich der Wurzeln, Stängel und Blätter in jedem Wachstumsstadium5. Das häufigste Symptom der Krankheit ist die schwarze Basis des Stiels. Die Wurzeln sind zunächst als wassergetränkt sichtbar und werden dann nekrotisch, und die Blätter zeigen große kreisförmige Läsionen5. Diese Krankheit kann für eine Tabakpflanze sowohl im Gewächshaus als auch auf dem Feld verheerend sein6. Die praktischste und wirtschaftlichste Methode zur Bekämpfung von P. nicotianae ist die Verwendung resistenter Sorten7. Für die Identifizierung von P. nicotianae-resistenten Akzessionen aus Tabakkeimplasma-Sammlungen ist jedoch ein wirksames Screening-Protokoll erforderlich.
Zur Beurteilung der P. nicotianae-Resistenz in Tabak wurden verschiedene Identifizierungsmethoden beschrieben7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Im Allgemeinen wurden drei Hauptansätze zur Identifizierung von P. nicotianae-resistenten Tabakgenotypen verwendet. Die erste beinhaltet das Mischen von Myzelien mit Agarmedium auf Petriplatten, die P. nicotianae enthalten. Die Myzelien werden dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 Wochen kultiviert. 1 L deionisiertes Wasser wird der Myzelie zugesetzt und für 30 s homogenisiert. Das Inokulum wird bis zum Bedarf auf Eis gehalten. Zwei Löcher (1 cm Durchmesser und 4-5 cm tief) werden auf jeder Seite der Pflanze gemacht, und 10 ml des Inokulums werden in jedes Loch gegossen. Die Löcher werden dann mit dem umgebenden Boden gefüllt, und die Krankheitsentwicklung wird täglich für 2 Wochen überwacht8,10.
Bei der zweiten Methode werden die Pflanzen mit pathogenverseuchten Zahnstochern beimpft. Für diesen Ansatz sollten die Pflanzen ca. 6 Wochen nach dem Umpflanzen verwendet werden und eine Mindesthöhe von 30 cm haben. Autoklavierte Zahnstocher werden auf die Oberfläche von Kulturen gelegt, die P. nicotianae mycelia enthalten. Die Kulturschalen werden dann 7 Tage lang unter dem Licht bei Raumtemperatur gelagert. Dann werden kolonisierte Zahnstocher verwendet, um die Pflanzen zu impfen. Zahnstocher werden in die Tabakstiele zwischen dem vierten und fünften Knoten eingeführt. Die Pflanzen werden täglich für 5 Tage überwacht9,15. Diese Methode ist nicht für kleine Sämlinge anwendbar. Da es sich bei dem Inokulum um pathogenverseuchte Zahnstocher handelt, kann die Impfintensität nicht genau gesteuert werden.
Der am häufigsten verwendete Ansatz beinhaltet Haferkörner zur Impfung. In diesem Fall werden Haferkörner hergestellt, indem 500 ml Hafer und 300 ml deionisiertes Wasser bei 121 ° C für 1 h einmal täglich für 3 Tage autoklaviert werden. Dann werden Haferkörner dem pathogen-besiedelten Kulturmedium hinzugefügt. Das Geschirr wird mit Paraffinfolie verschlossen und bei 25 °C bei Licht für 7-12 Tage inkubiert. Vier separate 5 cm tiefe Löcher werden auf der Blumenerde gemacht, 4 cm von jeder Pflanze, und ein pathogenbefallenes Haferkorn wird in jedes Loch gegeben. Die Inkubationszeit wird basierend darauf bestimmt, wann das erste oberirdische Symptom auftritt7,11,12,13,14,15,16. Diese Methode ist effizient und anwendbar für das großflächige Widerstandsscreening. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass das Inokulum aus pathogenverseuchten Haferkörnern besteht, so dass die Impfintensität nicht genau gesteuert werden kann.
Hier wird jedoch eine genauere Methode vorgestellt, die auf die Bewertung der Wachstumskammerresistenz anwendbar ist. Im Vergleich zu den anderen Ansätzen ist das Inokulum Zoosporensuspension, daher ist die Impfintensität kontrollierbar und einstellbar. Da die Tabakpflanzen in dieser Studie ohne Erde angebaut werden, sind die Ergebnisse leichter zu beobachten. Darüber hinaus verursacht die Probenahme von Pflanzenwurzeln aus dem Boden immer Schäden an den Wurzeln, was eine Reihe von physiologischen Reaktionen hervorruft17. Da bei dieser Methode Pflanzen ohne Erde angebaut werden, kann der Eingriff in Wurzelschäden beseitigt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode für die Erforschung molekularer Mechanismen und die Präzisionszüchtung praktischer ist. Mit diesem Protokoll werden die Daten in der Regel innerhalb von 5 Tagen gewonnen, wobei mehr als 200 Pflanzen in einem einzigen Experiment bewertet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Resistenzquellen wurden verwendet, um die Resistenz von P. nicotianae in Kulturtabak zu verbessern. Einzelne dominante R-Gene, Php und Phl, wurden von Nicotiana plumbaginifolia bzw. Nicotiana longiflora introgressiert10. Die Zigarrentabaksorte Beinhart 1000 weist die höchste berichtete quantitative Resistenz gegen P. nicotianae13 auf. Mehrere Intervallkartierungsexperimente haben gezeigt, dass mindestens sechs q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31571738) und dem Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01) finanziert.
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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