यहां, रोपाई में फाइटोफ्थोरा निकोटियाने प्रतिरोध के लिए तम्बाकू जीनोटाइप की कुशल और सटीक स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह सटीक प्रजनन के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है, साथ ही आणविक तंत्र अनुसंधान भी है।
काले शैंक, oomycetes Phytophthora nicotianae के कारण होता है, तम्बाकू के लिए विनाशकारी है, और यह रोगज़नक़ कई solanaceous फसलों के लिए अत्यधिक रोगजनक है। P. nicotianae अच्छी तरह से उच्च तापमान के लिए अनुकूलित है; इसलिए, इस रोगज़नक़ पर शोध ग्लोबल वार्मिंग के कारण दुनिया भर में कृषि में महत्व प्राप्त कर रहा है। तम्बाकू के पौधों की पी. निकोटियाने-प्रतिरोधी किस्मों की जांच आमतौर पर पी. निकोटियाने द्वारा उपनिवेशित जई के अनाज के साथ टीका लगाने और रोग के लक्षणों की निगरानी करके की जाती है। हालांकि, टीकाकरण की तीव्रता को मापना मुश्किल है क्योंकि इस मामले में सटीक टीकाकरण महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन का उद्देश्य पी. निकोटियाने के साथ संक्रमण के लिए तम्बाकू के प्रतिरोध का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि विकसित करना है। प्रतिरोधी किस्मों की पहचान करने के लिए इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, और टीकाकरण दक्षता की पुष्टि वास्तविक समय पीसीआर द्वारा की गई थी। इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रतिरोध मूल्यांकन विधि सटीक प्रजनन के लिए कुशल और व्यावहारिक है, साथ ही आणविक तंत्र अनुसंधान भी है।
P. nicotianae कई solanaceous फसलों के लिए विनाशकारी है। यह तम्बाकू “काले शंक” 1, आलू के पत्ते और कंद सड़न 2, टमाटर और मीठी मिर्च मुकुट और जड़ सड़ांध 3, और Goji कॉलर और जड़ rot4 का कारण बन सकता है। पी nicotianae किसी भी बढ़ते चरण में जड़ों, तनों, और पत्तियों सहित तम्बाकू पौधों के सभी भागों पर हमला कर सकते हैं5. रोग का सबसे आम लक्षण डंठल का काला आधार है। जड़ें शुरू में पानी से लथपथ के रूप में दिखाई देती हैं और फिर परिगलित हो जाती हैं, और पत्तियां बड़े परिपत्र घावों को दिखाती हैं5। यह बीमारी ग्रीनहाउस में एक तंबाकू के पौधे के साथ-साथ फील्ड 6 में विनाशकारी हो सकती है। पी nicotianae को नियंत्रित करने के लिए सबसे व्यावहारिक और किफायती तरीका प्रतिरोधी किस्मों का उपयोग है7. तथापि, तम्बाकू जर्मप्लाज्म संग्रहों से पी निकोटियाने-प्रतिरोधी परिग्रहणों की पहचान के लिए एक प्रभावी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
तम्बाकू में पी. निकोटियाने प्रतिरोध का आकलन करने के लिए विभिन्न पहचान विधियों का वर्णन किया गया है7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. सामान्य तौर पर, पी. निकोटियाना-प्रतिरोधी तम्बाकू जीनोटाइप की पहचान के लिए तीन प्रमुख दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है। पहले पेट्री प्लेटों पर आगर माध्यम के साथ mycelia मिश्रण पी nicotianae युक्त शामिल हैं. माइसेलिया को तब 2 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में खेती की जाती है। विआयनीकृत पानी के 1 एल को माइसेलिया में जोड़ा जाता है और 30 सेकंड के लिए homogenized किया जाता है। इनोकुलम को जरूरत पड़ने तक बर्फ पर रखा जाता है। पौधे के प्रत्येक पक्ष पर दो छेद (व्यास में 1 सेमी और 4-5 सेमी गहरा) बनाए जाते हैं, और प्रत्येक छेद में 10 मिलीलीटर इनोकुलम डाला जाता है। छेद तब आसपास की मिट्टी से भरे होते हैं, और रोग के विकास की निगरानी 2 सप्ताह 8,10 के लिए दैनिक रूप से की जाती है।
दूसरी विधि में, पौधों को रोगज़नक़-प्रभावित टूथपिक्स के साथ संक्रमित किया जाता है। इस दृष्टिकोण के लिए, पौधों को प्रत्यारोपण के लगभग 6 सप्ताह बाद उपयोग किया जाना चाहिए और इसकी न्यूनतम ऊंचाई 30 सेमी होनी चाहिए। Autoclaved toothpicks P. nicotianae mycelia युक्त संस्कृतियों की सतह पर रखा जाता है। संस्कृति व्यंजन तब 7 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश के नीचे संग्रहीत किए जाते हैं। फिर, पौधों को टीका लगाने के लिए उपनिवेशित टूथपिक्स का उपयोग किया जाता है। टूथपिक्स चौथे और पांचवें नोड्स के बीच तम्बाकू के तनों में डाले जाते हैं। पौधों की दैनिक निगरानी 5 दिनों के लिए की जाती है9,15। यह विधि छोटे रोपाई के लिए लागू नहीं है। चूंकि इनोकुलम रोगज़नक़-प्रभावित टूथपिक्स है, इसलिए टीकाकरण की तीव्रता को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।
सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण में टीकाकरण के लिए जई के दाने शामिल हैं। इस मामले में, जई के अनाज को 500 मिलीलीटर जई और 300 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी को 121 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए प्रति दिन एक बार 1 घंटे के लिए ऑटोक्लेव करके तैयार किया जाता है। फिर, जई के अनाज को रोगज़नक़-उपनिवेशित संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। व्यंजनों को पैराफिन फिल्म के साथ सील कर दिया जाता है और 7-12 दिनों के लिए प्रकाश में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। पॉटिंग मिट्टी पर चार अलग-अलग 5 सेमी गहरे छेद बनाए जाते हैं, प्रत्येक पौधे से 4 सेमी, और प्रत्येक छेद में एक रोगज़नक़-प्रभावित जई अनाज रखा जाता है। इनक्यूबेशन अवधि इस आधार पर निर्धारित की जाती है कि पहला उपर्युक्त लक्षण 7,11,12,13,14,15,16 होता है। यह विधि कुशल है और बड़े पैमाने पर प्रतिरोध स्क्रीनिंग के लिए लागू होती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि इनोकुलम रोगज़नक़-प्रभावित जई के दाने हैं, इसलिए टीकाकरण तीव्रता को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।
हालांकि, यहां प्रस्तुत एक अधिक सटीक विधि है जो विकास कक्ष प्रतिरोध मूल्यांकन पर लागू होती है। अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, इनोकुलम ज़ूस्पोर निलंबन है, इसलिए इनोक्यूलेशन तीव्रता नियंत्रणीय और समायोज्य है। चूंकि इस अध्ययन में तम्बाकू के पौधों की खेती मिट्टी के बिना की जाती है, इसलिए परिणामों का निरीक्षण करना आसान होता है। इसके अलावा, मिट्टी से पौधे की जड़ों का नमूना हमेशा जड़ों को नुकसान पहुंचाता है, जो शारीरिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को प्रेरित करता है। इस विधि में, चूंकि पौधों की खेती मिट्टी के बिना की जाती है, इसलिए जड़ क्षति में हस्तक्षेप को समाप्त किया जा सकता है। अंत में, यह विधि आणविक तंत्र अनुसंधान और सटीक प्रजनन के लिए अधिक व्यावहारिक है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, डेटा आमतौर पर 5 दिनों के भीतर प्राप्त किया जाता है, जिसमें एक ही प्रयोग में 200 से अधिक पौधों का मूल्यांकन किया जाता है।
खेती किए गए तम्बाकू में पी. निकोटियाने प्रतिरोध में सुधार करने के लिए कई प्रतिरोध स्रोतों का उपयोग किया गया है। एकल प्रमुख आर जीन, Php और Phl, Nicotiana plumbaginifolia और Nicotiana longiflora, क्रमशः 10 से introgressed क?…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31571738) और चीन के कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम (ASTIP-TRIC01) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
(NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |