Screening dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae
Summary
Qui viene presentato un protocollo per lo screening efficiente e accurato dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae nelle piantine . Questo è un approccio pratico per l’allevamento di precisione, così come la ricerca sui meccanismi molecolari.
Abstract
Il gambo nero, causato dall’oomiceti Phytophthora nicotianae, è distruttivo per il tabacco e questo agente patogeno è altamente patogeno per molte colture solanacee. P. nicotianae è ben adattato alle alte temperature; pertanto, la ricerca su questo agente patogeno sta guadagnando importanza in agricoltura in tutto il mondo a causa del riscaldamento globale. Le varietà di piante di tabacco resistenti a P. nicotianae sono comunemente sottoposte a screening mediante inoculazione con chicchi d’avena colonizzati da P. nicotianae e monitoraggio dei sintomi della malattia. Tuttavia, è difficile quantificare l’intensità dell’inoculazione poiché l’inoculazione accurata è cruciale in questo caso. Questo studio mirava a sviluppare un metodo efficiente e affidabile per valutare la resistenza del tabacco all’infezione da P. nicotianae. Questo metodo è stato utilizzato con successo per identificare varietà resistenti e l’efficienza dell’inoculazione è stata confermata dalla PCR in tempo reale. Il metodo di valutazione della resistenza presentato in questo studio è efficiente e pratico per l’allevamento di precisione, così come la ricerca sui meccanismi molecolari.
Introduction
P. nicotianae è distruttivo per molte colture solanacee. Può causare tabacco “gambo nero”1, marciume fogliare e tubero di patate2, corona di pomodoro e peperone dolce e marciume radicale3 e colletto e marciume radicale di Goji4. P. nicotianae può attaccare tutte le parti delle piante di tabacco, comprese le radici, i gambi e le foglie in qualsiasi fase di crescita5. Il sintomo più comune della malattia è la base nera del gambo. Le radici sono inizialmente visibili come imbevute d’acqua e poi diventano necrotiche, e le foglie mostrano grandi lesioni circolari5. Questa malattia può essere devastante per una pianta di tabacco in serra, così come sul campo6. Il metodo più pratico ed economico per controllare P. nicotianae è l’uso di varietà resistenti7. Tuttavia, è necessario un protocollo di screening efficace per l’identificazione delle accessioni resistenti a P. nicotianae dalle collezioni di germoplasma del tabacco.
Sono stati descritti vari metodi di identificazione per valutare la resistenza a P. nicotianae nel tabacco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. In generale, sono stati utilizzati tre approcci principali per l’identificazione dei genotipi del tabacco resistenti a P. nicotianae. Il primo include la miscelazione di miceli con mezzo agar su piastre di Petri contenenti P. nicotianae. I miceli vengono poi coltivati al buio a temperatura ambiente per 2 settimane. 1 L di acqua deionizzata viene aggiunta ai miceli e omogeneizzata per 30 s. L’inoculo viene tenuto sul ghiaccio fino a quando non è necessario. Due fori (1 cm di diametro e 4-5 cm di profondità) sono fatti su ciascun lato della pianta, e 10 ml di inoculo vengono versati in ogni foro. I fori vengono quindi riempiti con il terreno circostante e lo sviluppo della malattia viene monitorato quotidianamente per 2 settimane8,10.
Nel secondo metodo, le piante vengono inoculate con stuzzicadenti infestati da agenti patogeni. Per questo approccio, le piante dovrebbero essere utilizzate circa 6 settimane dopo il trapianto e dovrebbero avere un’altezza minima di 30 cm. Gli stuzzicadenti autoclavati sono posti sulla superficie di colture contenenti miceli di P. nicotianae. I piatti di coltura vengono quindi conservati sotto la luce a temperatura ambiente per 7 giorni. Quindi, gli stuzzicadenti colonizzati vengono utilizzati per inoculare le piante. Gli stuzzicadenti vengono inseriti nei gambi del tabacco tra il quarto e il quinto nodo. Le piante sono monitorate quotidianamente per 5 giorni9,15. Questo metodo non è applicabile per piantine di piccole dimensioni. Poiché l’inoculo è costituito da stuzzicadenti infestati da agenti patogeni, l’intensità dell’inoculazione non può essere controllata con precisione.
L’approccio più frequentemente utilizzato coinvolge i chicchi d’avena per l’inoculazione. In questo caso, i chicchi d’avena vengono preparati in autoclave 500 mL di avena e 300 mL di acqua deionizzata a 121 °C per 1 ora una volta al giorno per 3 giorni. Quindi, i chicchi d’avena vengono aggiunti al terreno di coltura colonizzato dall’agente patogeno. Le piastre sono sigillate con film di paraffina e incubate a 25 °C alla luce per 7-12 giorni. Quattro fori separati profondi 5 cm sono fattisull’terriccio, 4 cm da ogni pianta, e un chicco d’avena infestato da agenti patogeni viene posto in ogni foro. Il periodo di incubazione è determinato in base a quando si verifica il primo sintomo fuori terra7,11,12,13,14,15,16. Questo metodo è efficiente e applicabile per lo screening della resistenza su larga scala. Tuttavia, una limitazione di questo approccio è che l’inoculo è costituito da chicchi d’avena infestati da agenti patogeni, quindi l’intensità dell’inoculazione non può essere controllata con precisione.
Tuttavia, qui è presentato un metodo più accurato applicabile alla valutazione della resistenza della camera di crescita. Rispetto agli altri approcci, l’inoculo è in sospensione di zoospore, quindi l’intensità dell’inoculazione è controllabile e regolabile. Poiché le piante di tabacco in questo studio sono coltivate senza terra, i risultati sono più facili da osservare. Inoltre, il campionamento delle radici delle piante dal terreno provoca sempre danni alle radici, il che induce una serie di risposte fisiologiche17. In questo metodo, poiché le piante vengono coltivate senza suolo, l’interferenza nel danno alle radici può essere eliminata. In conclusione, questo metodo è più pratico per la ricerca sui meccanismi molecolari e l’allevamento di precisione. Utilizzando questo protocollo, i dati vengono in genere ottenuti entro 5 giorni, con più di 200 piante valutate in un singolo esperimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molteplici fonti di resistenza sono state utilizzate per migliorare la resistenza di P. nicotianae nel tabacco coltivato. Singoli geni R dominanti, Php e Phl, sono stati introgrediti da Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, rispettivamente10. La varietà di tabacco da sigaro Beinhart 1000 ha il più alto livello riportato di resistenza quantitativa a P. nicotianae13. Molteplici esperimenti di mappatura degli …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31571738) e dall’Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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