フィトフトラ・ニコチアナエ耐性に対するタバコ遺伝子型のスクリーニング
Summary
ここでは、苗木における Phytophthora nicotianae 耐性についてのタバコ遺伝子型の効率的かつ正確なスクリーニングのためのプロトコルが提示される。これは、精密育種や分子機構研究のための実用的なアプローチです。
Abstract
卵菌類Phytophthora nicotianaeによって引き起こされる黒いシャンクは、タバコに対して破壊的であり、この病原体は多くのナス科作物に対して高病原性である。P.ニコチアナエは高温によく適応しています。したがって、この病原体の研究は、地球温暖化のために世界中の農業で重要性を増しています。タバコ植物のP. nicotianae耐性品種は、一般に、P. nicotianaeによってコロニー形成されたオート麦粒を接種し、疾患症状をモニタリングすることによってスクリーニングされる。しかし、この場合は正確な接種が重要であるため、接種強度を定量化することは困難である。この研究は、P. nicotianaeの感染に対するタバコの耐性を評価するための効率的で信頼性の高い方法を開発することを目的としていた。この方法は抵抗性品種の同定に成功しており、リアルタイムPCRにより接種効率が確認されました。本研究で提示した抵抗性評価方法は、精密育種や分子機構研究に効率的かつ実用的である。
Introduction
P. nicotianae は多くのナス科作物に破壊的です。タバコの「ブラックシャンク」1、ジャガイモの葉と塊茎の腐敗2、トマトとピーマンの冠と根腐れ3、ゴジカラーと根腐れ4を引き起こす可能性があります。 P. nicotianae は、任意の成長段階で根、茎、葉を含むタバコ植物のすべての部分を攻撃することができます5。この病気の最も一般的な症状は、茎の黒い基部です。根は最初は水に浸されたように見え、その後壊死し、葉は大きな円形の病変を示します5。この病気は、温室内のタバコ植物や畑のタバコ植物に壊滅的な影響を与える可能性があります6。 P. nicotianae を防除するための最も実用的で経済的な方法は、抵抗性品種の使用です7。しかしながら、タバコ生殖質コレクションからの P.ニコチアナエ耐性アクセッションの同定には、効果的なスクリーニングプロトコルが必要である。
タバコ中のニコチアナエ菌耐性を評価するために様々な同定方法が記載されている7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。一般に、P. nicotianae耐性タバコ遺伝子型の同定には、3つの主要なアプローチが用いられてきた。第1は、菌糸体をP.ニコチアナエを含むペトリプレート上で寒天培地と混合することを含む。その後、菌糸体を室温で暗所で2週間培養する。1Lの脱イオン水を菌糸体に加え、30秒間均質化する。接種物は必要になるまで氷の上に保たれます。植物の両側に2つの穴(直径1cm、深さ4〜5cm)を作り、各穴に10mLの種菌を注ぐ。その後、穴は周囲の土壌で埋められ、病気の発症は2週間毎日監視されます8,10。
第2の方法では、植物に病原体が寄生した爪楊枝を接種する。このアプローチでは、移植後約6週間で植物を使用し、最低身長30cmにする必要があります。オートクレーブ処理された爪楊枝は、P. nicotianae菌糸体を含む培養物の表面に置かれる。次いで、培養皿を、室温で光の下で7日間保存する。次に、コロニー形成された爪楊枝を使用して植物を接種する。爪楊枝は、第4節と第5節の間のタバコ茎に挿入される。植物は毎日5日間監視されています9,15。この方法は、小さな苗には適用できません。接種源は病原体が蔓延する爪楊枝であるため、接種強度を正確に制御することはできません。
最も頻繁に使用されるアプローチは、接種のためのオート麦穀物を含む。この場合、オート麦粒は、500mLのオートクレーブおよび300mLの脱イオン水を121°Cで1日1回、3日間オートクレーブ処理することによって調製される。次いで、オート麦粒が病原体コロニー形成培養培地に添加される。ディッシュをパラフィンフィルムで密封し、光中25°Cで7〜12日間インキュベートした。鉢植えの土壌に4つの別々の5cmの深さの穴が作られ、各植物から4cm、病原体が蔓延するオート麦粒が各穴に1つ入れられます。潜伏期間は、最初の地上の症状がいつ発生したかに基づいて決定されます7、11、12、13、14、15、16。この方法は効率的で、大規模な抵抗スクリーニングに適用できます。しかし、このアプローチの1つの制限は、接種物が病原体に寄生するオート麦粒であるため、接種強度を正確に制御できないことである。
しかし、ここで提示されるのは、成長チャンバ抵抗評価に適用可能なより正確な方法である。他のアプローチと比較して、接種物は遊走子懸濁液であり、したがって接種強度は制御可能かつ調整可能である。この研究のタバコ植物は土壌なしで栽培されているため、結果は観察しやすい。さらに、土壌から植物の根をサンプリングすると、常に根に損傷を与え、一連の生理学的反応を誘発する17。この方法では、植物を土壌なしで栽培するので、根の損傷における干渉を排除することができる。結論として、この方法は分子メカニズム研究および精密育種にとってより実用的である。このプロトコルを使用すると、データは通常5日以内に得られ、1回の実験で200以上の植物が評価されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
栽培タバコにおけるP. nicotianae耐性を改善するために、複数の抵抗性源が用いられてきた。単一の優性R遺伝子であるPhpおよびPhlは、それぞれニコチアナ・プラムバギニフォリアおよびニコチアナ・ロンギフローラから侵入されている10。葉巻タバコ品種のBeinhart 1000は、P. nicotianae13に対する定量的耐性の報告された最?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(31571738)と中国農業科学技術イノベーションプログラム(ASTIP-TRIC01)から資金提供を受けました。
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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