Triagem de Genótipos de Tabaco para Resistência de Phytophthora nicotianae
Summary
Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. Trata-se de uma abordagem prática para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.
Abstract
A haste preta, causada pelos oomycetes Phytophthora nicotianae, é destrutiva para o tabaco, e este patógeno é altamente patogênico para muitas culturas solanáceos. P. nicotianae é bem adaptado a altas temperaturas; portanto, a pesquisa sobre esse patógeno está ganhando importância na agricultura mundial por causa do aquecimento global. As variedades resistentes à p. nicotianae de plantas de tabaco são comumente rastreadas pela inoculação com grãos de aveia colonizados por P. nicotianae e monitoramento dos sintomas da doença. No entanto, é difícil quantificar a intensidade da inoculação, uma vez que a inoculação precisa é crucial neste caso. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção com P. nicotianae. Este método tem sido usado com sucesso para identificar variedades resistentes, e a eficiência da inoculação foi confirmada por PCR em tempo real. O método de avaliação de resistência apresentado neste estudo é eficiente e prático para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.
Introduction
P. nicotianae é destrutivo para muitas culturas solanáceas. Pode causar tabaco “pernil preto”1, batata foliar e tuber rot2, tomate e pimenta doce coroa e raiz rot3, e goji colar e raiz rot4. P. nicotianae pode atacar todas as partes das plantas de tabaco, incluindo as raízes, caules e folhas em qualquer estágio de crescimento5. O sintoma mais comum da doença é a base negra do talo. As raízes são inicialmente visíveis como encharcadas de água e depois tornam-se necrosadas, e as folhas apresentam grandes lesões circulares5. Essa doença pode ser devastadora para uma planta de tabaco na estufa, bem como no campo6. O método mais prático e econômico para controlar p. nicotianae é o uso de variedades resistentes7. No entanto, é necessário um protocolo de triagem eficaz para a identificação de adesões resistentes à P. nicotianae a partir de coleções de germoplasma de tabaco.
Vários métodos de identificação foram descritos para avaliar a resistência à P. nicotianae no tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Em geral, três abordagens importantes têm sido utilizadas para a identificação de genótipos de tabaco resistentes à P. nicotianae. O primeiro inclui a mistura de micélia com meio de ágar em placas de Petri contendo P. nicotianae. As micélias são então cultivadas no escuro à temperatura ambiente por 2 semanas. 1 L de água deionizada é adicionado à micélia e homogeneizado para 30 s. O inóculo é mantido no gelo até que seja necessário. Dois orifícios (1 cm de diâmetro e 4-5 cm de profundidade) são feitos em cada lado da planta, e 10 mL do inóculo são derramados em cada orifício. Os buracos são então preenchidos com o solo circundante, e o desenvolvimento de doenças é monitorado diariamente por 2 semanas8,10.
No segundo método, as plantas são inoculadas com palitos infestados de patógenos. Para esta abordagem, as plantas devem ser utilizadas aproximadamente 6 semanas após o transplante e devem ter uma altura mínima de 30 cm. Palitos de dente autoclavados são colocados na superfície de culturas que contêm P. nicotianae mycelia. Os pratos de cultura são então armazenados sob a luz à temperatura ambiente por 7 dias. Então, palitos colonizados são usados para vacinar as plantas. Palitos de dente são inseridos nas hastes de tabaco entre o quarto e o quinto nós. As plantas são monitoradas diariamente durante 5 dias9,15. Este método não é aplicável para pequenas mudas. Como o inóculo é um palito infestado de patógenos, a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
A abordagem mais utilizada envolve grãos de aveia para inoculação. Neste caso, os grãos de aveia são preparados por autoclaving 500 mL de aveia e 300 mL de água deionizada a 121 °C por 1h uma vez por dia durante 3 dias. Em seguida, os grãos de aveia são adicionados ao meio de cultura colonizada por patógenos. Os pratos são selados com filme de parafina e incubados a 25 °C em luz por 7-12 dias. Quatro buracos de 5 cm de profundidade separados são feitos no solo de vasos, 4 cm de cada planta, e um grão de aveia infestado de patógenos é colocado em cada orifício. O período de incubação é determinado com base em quando o primeiro sintoma acima do solo ocorre7,11,12,13,14,15,16. Este método é eficiente e aplicável para a triagem de resistência em larga escala. No entanto, uma limitação dessa abordagem é que o inóculo é de grãos de aveia infestados de patógenos, portanto a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
No entanto, aqui apresentado é um método mais preciso que é aplicável à avaliação da resistência da câmara de crescimento. Em comparação com as outras abordagens, o inóculo é a suspensão do zoospore, portanto a intensidade da inoculação é controlável e ajustável. Como as plantas de tabaco neste estudo são cultivadas sem solo, os resultados são mais fáceis de observar. Além disso, a amostragem das raízes vegetais do solo sempre causa danos às raízes, o que induz uma série de respostas fisiológicas17. Neste método, como as plantas são cultivadas sem solo, a interferência no dano radicular pode ser eliminada. Em conclusão, este método é mais prático para pesquisa de mecanismos moleculares e criação de precisão. Usando este protocolo, os dados são normalmente obtidos dentro de 5 dias, com mais de 200 plantas avaliadas em um único experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Múltiplas fontes de resistência têm sido usadas para melhorar a resistência à P. nicotianae no tabaco cultivado. Os genes R dominantes únicos, Php e Phl, foram introgressados de Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, respectivamente10. A variedade de tabaco de charuto Beinhart 1000 tem o maior nível de resistência quantitativa relatado a P. nicotianae13. Experimentos de mapeamento de intervalo múltipl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31571738) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola da China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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