Скрининг генотипов табака на устойчивость к Phytophthora nicotianae
Summary
Здесь представлен протокол эффективного и точного скрининга генотипов табака на устойчивость Phytophthora nicotianae у саженцев. Это практический подход к точному разведению, а также исследованию молекулярного механизма.
Abstract
Черная голяшка, вызванная оомицетами Phytophthora nicotianae, губительна для табака, и этот патоген высокопатогенен для многих пасленовых культур. P. nicotianae хорошо приспособлен к высоким температурам; поэтому исследования этого патогена приобретают все большее значение в сельском хозяйстве во всем мире из-за глобального потепления. Устойчивые к P. nicotianae сорта табачных растений обычно проверяются путем инокуляции овсяными зернами, колонизированными P. nicotianae , и мониторинга симптомов заболевания. Тем не менее, трудно количественно оценить интенсивность прививки, поскольку точная инокуляция имеет решающее значение в этом случае. Данное исследование было направлено на разработку эффективного и надежного метода оценки устойчивости табака к инфекции P. nicotianae. Этот метод был успешно использован для идентификации резистентных сортов, а эффективность инокуляции была подтверждена ПЦР в режиме реального времени. Метод оценки резистентности, представленный в этом исследовании, является эффективным и практичным для точного разведения, а также исследования молекулярного механизма.
Introduction
P. nicotianae губителен для многих пасленовых культур. Он может вызвать табачную «черную голяшку»1, картофельную лиственную и клубневую гниль2, корону томата и сладкого перца и корневую гниль3, а также ошейник годжи и корневую гниль4. P. nicotianae может атаковать все части табачных растений, включая корни, стебли и листья на любой стадии роста5. Наиболее распространенным симптомом заболевания является черное основание стебля. Корни первоначально видны как пропитанные водой, а затем становятся некротическими, а листья показывают большие круговые поражения5. Это заболевание может быть разрушительным для табачного растения в теплице, а также в поле6. Наиболее практичным и экономичным методом борьбы с P. nicotianae является использование устойчивых сортов7. Однако для идентификации устойчивых к P. nicotianae соединений из коллекций зародышевой плазмы табака требуется эффективный протокол скрининга.
Были описаны различные методы идентификации для оценки устойчивости P. nicotianae у табака7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. В целом для идентификации генотипов табака, устойчивых к P. nicotianae, использовались три основных подхода. Первый включает смешивание мицелия с агаровой средой на пластинах Петри, содержащих P. nicotianae. Затем мицелий культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2 недель. 1 л деионизированной воды добавляют в мицелий и гомогенизируют в течение 30 с. Инокулят держат на льду до тех пор, пока это не понадобится. С каждой стороны растения делают по два отверстия (диаметром 1 см и глубиной 4-5 см), и в каждое отверстие заливается 10 мл инокулята. Затем отверстия заполняются окружающей почвой, а развитие болезни контролируется ежедневно в течение 2 недель8,10.
Во втором способе растения прививают зараженными патогенами зубочистками. Для такого подхода растения следует использовать примерно через 6 недель после пересадки и должны иметь минимальную высоту 30 см. Автоклавные зубочистки размещают на поверхности культур, содержащих мицелий P. nicotianae. Затем блюда для культуры хранят при свете при комнатной температуре в течение 7 дней. Затем колонизированные зубочистки используются для вакцинации растений. Зубочистки вставляются в стебли табака между четвертым и пятым узлами. Растения контролируются ежедневно в течение 5 дней9,15. Этот метод не применим для мелких саженцев. Поскольку инокулятив является зараженным патогенами зубочистками, интенсивность прививки не может точно контролироваться.
Наиболее часто используемый подход включает в себя зерна овса для прививки. В этом случае зерна овса готовят путем автоклавирования 500 мл овса и 300 мл деионизированной воды при 121 °С в течение 1 ч один раз в сутки в течение 3 дней. Затем зерна овса добавляют в колонизированную патогенами культуральную среду. Посуду запечатывают парафиновой пленкой и инкубируют при 25 °C при свете в течение 7-12 дней. На почве для горшков делаются четыре отдельных отверстия глубиной 5 см, по 4 см от каждого растения, и в каждое отверстие помещается одно зараженное патогенами зерно овса. Инкубационный период определяется исходя из того, когда возникает первый надземный симптом7,11,12,13,14,15,16. Этот метод эффективен и применим для крупномасштабного скрининга сопротивления. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что инокулят является зараженным патогенами зернами овса, поэтому интенсивность прививки не может точно контролироваться.
Однако здесь представлен более точный метод, который применим к оценке сопротивления камеры роста. По сравнению с другими подходами, инокулятум представляет собой зооспоровую суспензию, поэтому интенсивность прививки контролируется и регулируется. Поскольку растения табака в этом исследовании культивируются без почвы, результаты легче наблюдать. Кроме того, отбор проб корней растений из почвы всегда приводит к повреждению корней, что вызывает ряд физиологических реакций17. В этом методе, поскольку растения культивируются без почвы, вмешательство в повреждение корней может быть устранено. В заключение, этот метод более практичен для исследования молекулярных механизмов и точного разведения. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 5 дней, при этом более 200 растений оцениваются в одном эксперименте.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многочисленные источники резистентности были использованы для улучшения устойчивости P. nicotianae в культивируемом табаке. Одиночные доминантные гены R, Php и Phl, были интрогрессированы из Nicotiana plumbaginifolia и Nicotiana longiflora, соответственно10. Сорт сигарного таба?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31571738) и Инновационной программой сельскохозяйственной науки и техники Китая (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco ‘Beinhart 1000’ × ‘Hicks’ mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
