Phytophthora nicotianae Direnci için Tütün Genotiplerinin Taranması
Summary
Burada, fidelerde Phytophthora nicotianae direnci için tütün genotiplerinin etkili ve doğru bir şekilde taranması için bir protokol sunulmaktadır. Bu, hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için pratik bir yaklaşımdır.
Abstract
Oomycetes Phytophthora nicotianae’nin neden olduğu siyah sap, tütün için yıkıcıdır ve bu patojen birçok solanlı ürün için oldukça patojeniktir. P. nicotianae yüksek sıcaklıklara iyi adapte olmuşlardır; bu nedenle, bu patojen üzerine yapılan araştırmalar, küresel ısınma nedeniyle dünya çapında tarımda önem kazanmaktadır. P. nicotianae’ye dirençli tütün bitkileri çeşitleri, P. nicotianae tarafından kolonize edilen yulaf taneleri ile aşılama ve hastalık semptomlarının izlenmesi ile yaygın olarak taranır. Bununla birlikte, aşılama yoğunluğunu ölçmek zordur, çünkü bu durumda doğru aşılama çok önemlidir. Bu çalışmada tütünün P. nicotianae ile enfeksiyona karşı direncini değerlendirmek için etkili ve güvenilir bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntem, dirençli çeşitleri tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır ve aşılama etkinliği gerçek zamanlı PCR ile doğrulanmıştır. Bu çalışmada sunulan direnç değerlendirme yöntemi, hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için de verimli ve pratiktir.
Introduction
P. nicotianae birçok solanlı ürün için yıkıcıdır. Tütün “siyah sap”1, patates yaprağı ve yumru çürüklüğüne2, domates ve tatlı biber tacı ve kök rot3’e ve Goji yaka ve kök çürüklüğüne4 neden olabilir. P. nicotianae, herhangi bir büyüme aşamasında kökler, gövdeler ve yapraklar da dahil olmak üzere tütün bitkilerinin tüm kısımlarına saldırabilir5. Hastalığın en yaygın semptomu sapın siyah tabanıdır. Kökler başlangıçta suya batırılmış olarak görülür ve daha sonra nekrotik hale gelir ve yapraklar büyük dairesel lezyonlar gösterir5. Bu hastalık, seradaki bir tütün bitkisine ve tarlaya zarar verebilir6. P. nicotianae’yi kontrol etmek için en pratik ve ekonomik yöntem, dirençli çeşitlerin kullanılmasıdır7. Bununla birlikte, tütün germplazma koleksiyonlarından P. nikotine’e dirençli katılımların tanımlanması için etkili bir tarama protokolü gereklidir.
Tütünde P. nikotinae direncini değerlendirmek için çeşitli tanımlama yöntemleri tanımlanmıştır7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Genel olarak, P. nikotinae dirençli tütün genotiplerinin tanımlanmasında üç ana yaklaşım kullanılmıştır. Birincisi, P. nicotianae içeren Petri plakalarında miselinin agar ortamı ile karıştırılmasını içerir. Miselya daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 2 hafta boyunca yetiştirilir. Miseliye 1 L deiyonize su ilave edilir ve 30 s homojenize edilir. İnokulum ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutulur. Bitkinin her iki tarafında iki delik (1 cm çapında ve 4-5 cm derinliğinde) yapılır ve her deliğe 10 mL inokülum dökülür. Delikler daha sonra çevredeki toprakla doldurulur ve hastalık gelişimi 2 hafta boyunca günlük olarak izlenir8,10.
İkinci yöntemde, bitkiler patojen istilasına uğramış kürdanlarla aşılanır. Bu yaklaşım için, bitkiler ekimden yaklaşık 6 hafta sonra kullanılmalı ve minimum 30 cm yüksekliğe sahip olmalıdır. Otoklavlanmış kürdanlar, P. nicotianae miseli içeren kültürlerin yüzeyine yerleştirilir. Kültür yemekleri daha sonra 7 gün boyunca oda sıcaklığında ışık altında saklanır. Daha sonra, bitkileri aşılamak için kolonize kürdan kullanılır. Kürdanlar, dördüncü ve beşinci düğümler arasındaki tütün saplarına yerleştirilir. Bitkiler 5 gün boyunca günlük olarak izlenir9,15. Bu yöntem küçük fideler için geçerli değildir. İnokulum patojen istilasına uğramış kürdan olduğundan, aşılama yoğunluğu tam olarak kontrol edilemez.
En sık kullanılan yaklaşım, aşılama için yulaf tanelerini içerir. Bu durumda, yulaf taneleri 500 mL yulaf ve 300 mL deiyonize suyun 121 ° C’de 3 gün boyunca günde bir kez 1 saat otoklavlanması ile hazırlanır. Daha sonra, patojen-kolonize kültür ortamına yulaf taneleri eklenir. Yemekler parafin film ile kapatılır ve 7-12 gün boyunca ışıkta 25 ° C’de inkübe edilir. Saksı toprağında, her bitkiden 4 cm uzaklıkta dört ayrı 5 cm derinliğinde delik açılır ve her deliğe bir patojen istilasına uğramış yulaf tanesi yerleştirilir. Kuluçka süresi, ilk yer üstü semptomunun ne zaman ortaya çıktığına bağlı olarak belirlenir7,11,12,13,14,15,16. Bu yöntem verimlidir ve büyük ölçekli direnç taraması için uygulanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın bir sınırlaması, inokulumun patojen tarafından istila edilmiş yulaf taneleri olmasıdır, bu nedenle aşılama yoğunluğu tam olarak kontrol edilemez.
Bununla birlikte, burada sunulan büyüme odası direnci değerlendirmesine uygulanabilir daha doğru bir yöntemdir. Diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, inokülum zoospor süspansiyonudur, bu nedenle aşılama yoğunluğu kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Bu çalışmadaki tütün bitkileri topraksız olarak yetiştirildiğinden, sonuçların gözlemlenmesi daha kolaydır. Dahası, bitki köklerini topraktan örneklemek her zaman köklere zarar verir ve bu da bir dizi fizyolojik tepkiye neden olur17. Bu yöntemde bitkiler topraksız olarak yetiştirildiği için kök hasarına müdahale ortadan kaldırılabilir. Sonuç olarak, bu yöntem moleküler mekanizma araştırması ve hassas ıslah için daha pratiktir. Bu protokolü kullanarak, veriler tipik olarak 5 gün içinde elde edilir ve tek bir deneyde 200’den fazla bitki değerlendirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekili tütünde P. nicotianae direncini arttırmak için çoklu direnç kaynakları kullanılmıştır. Tek baskın R genleri, Php ve Phl, sırasıyla Nicotiana plumbaginifolia ve Nicotiana longiflora’dan içe geçmiştir10. Puro tütünü çeşidi Beinhart 1000, P. nicotianae13’e karşı bildirilen en yüksek kantitatif direnç seviyesine sahiptir. Çoklu aralıklı haritalama deneyleri, en az altı nicel özellik lokus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31571738) ve Çin Tarım Bilimi ve Teknolojisi İnovasyon Programı (ASTIP-TRIC01) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco ‘Beinhart 1000’ × ‘Hicks’ mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
