Måling av protein import kapasitet av skjelett muskel mitokondrier
Summary
Mitokondrier er viktige metabolske organeller som viser et høyt nivå av fenotypisk plastisitet i skjelettmuskulatur. Import av proteiner fra cytosol er en kritisk vei for organelle biogenese, avgjørende for utvidelse av retikulum og vedlikehold av mitokondriefunksjon. Derfor fungerer proteinimport som et barometer for cellulær helse.
Abstract
Mitokondrier er viktige metabolske og regulatoriske organeller som bestemmer energiforsyningen så vel som cellens generelle helse. I skjelettmuskulatur eksisterer mitokondrier i en rekke komplekse morfologier, alt fra små ovale organeller til et bredt, retikulumlignende nettverk. Å forstå hvordan mitokondrie-retikulumet utvider seg og utvikler seg som svar på ulike stimuli som endringer i energietterspørselen, har lenge vært et forskningstema. Et sentralt aspekt ved denne veksten, eller biogenese, er import av forløperproteiner, opprinnelig kodet av atomgenomet, syntetisert i cytosolen og omplassert til ulike mitokondrie-underrom. Mitokondrier har utviklet en sofistikert mekanisme for denne importprosessen, som involverer mange selektive indre og ytre membrankanaler, kjent som proteinimportmaskineriet (PIM). Import til mitokondrie er avhengig av levedyktig membranpotensial og tilgjengeligheten av organell-avledet ATP gjennom oksidativ fosforylering. Derfor kan målingen tjene som et mål på organelle helse. PIM har også et høyt nivå av adaptiv plastisitet i skjelettmuskulatur som er tett koblet til cellens energistatus. For eksempel har trening vist seg å øke importkapasiteten, mens muskeldisuse reduserer den, sammenfallende med endringer i markører av mitokondrieinnhold. Selv om proteinimport er et kritisk skritt i biogenesen og utvidelsen av mitokondrier, er prosessen ikke mye studert i skjelettmuskulatur. Dermed skisserer dette papiret hvordan man bruker isolerte og fullt funksjonelle mitokondrier fra skjelettmuskulatur for å måle proteinimportkapasitet for å fremme en større forståelse av metodene som er involvert og en forståelse av viktigheten av veien for organellomsetning i trening, helse og sykdom.
Introduction
Mitokondrier er organeller som eksisterer i komplekse morfologier i forskjellige celletyper og er anerkjent for å ha et økende utvalg av funksjoner som er kritiske for cellulær helse. Som sådan kan de ikke lenger sprutes ned bare til energiproduserende organeller. Mitokondrier er viktige metabolske regulatorer, determinanter for celle skjebne, og signalerende knutepunkter, hvis funksjoner kan tjene som nyttige indikatorer på generell cellulær helse. I skjelettmuskulaturceller viser elektronmikroskopistudier tilstedeværelsen av geografisk distinkte subsarcolemmal (SS) og intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som viser en grad av tilkoblingsmuligheter1,2,3,4 som nå er anerkjent for å være svært dynamisk og tilpasningsdyktig til endringer i skjelettmuskulaturaktivitetsnivåer, samt med alder og sykdom. Mitokondrieinnhold og funksjon i muskel kan vurderes på mange måter5,6, og tradisjonelle metoder for organelleisolasjon har blitt brukt for å bedre forstå respiratoriske og enzymatiske kapasiteter (Vmax) av mitokondrier forskjellig fra påvirkning av cellulære miljøer7,8. Spesielt har disse tradisjonelle metodene avslørt subtile biokjemiske forskjeller mellom mitokondrier isolert fra subsarcolemmale og intermyofibrillar regioner, belying mulige funksjonelle implikasjoner for metabolisme i disse subcellulære regionene8,9,10,11.
Biogenesen av mitokondrier er unik i å kreve bidrag av genprodukter fra både kjernefysisk og mitokondrie-DNA. Imidlertid er de aller fleste av disse avledet fra kjernen siden mtDNA transkripsjon bare fører til syntese av 13 proteiner. Siden mitokondrier normalt består av > 1000 proteiner involvert i ulike metabolske veier, krever biogenese av organellet et tett regulert importmiddel og montering av forløperproteiner fra cytosolen til de forskjellige mitokondrie-underrommene for å opprettholde riktig stoichiometri og funksjon12,13. Kjernefysiske kodede proteiner som skal til mitokondrier, har vanligvis en mitokondriemålrettingssekvens (MTS) som retter seg mot dem mot organellen og letter deres sub-romlige lokalisering. De fleste matrisebundne proteiner inneholder en cleavable N-terminal MTS, mens de som er bestemt for den ytre eller indre mitokondriemembranen vanligvis har interne målrettingsdomener14. Importprosessen utføres av et sett med forskjellige kanaler som gir flere veier for inngang til organelle13. Translocase av den ytre membranen (TOM) komplekse skyttelbusser forløpere fra cytosol inn i intermembrane rommet, hvor de er anerkjent av translocase av den indre membranen (TIM) komplekset. Dette komplekset er ansvarlig for å importere kjernefysiske forløpere til matrisen, der proteaser holder N-terminalen rettet mot presequence. Proteiner som er bestemt for den ytre membranen kan settes direkte inn i denne membranen gjennom TOM-komplekset, mens de som er bestemt for den indre membranen settes inn av et TIM-protein, spesielt TIM22. Etter importen blir proteiner videre behandlet av bosatte proteaser og anstander og kombineres ofte for å danne større komplekser, for eksempel de som finnes i elektrontransportkjeden.
Mitokondrieproteinimport i seg selv fungerer også som en måling av mitokondriehelse, da denne prosessen er avhengig av tilstedeværelsen av membranpotensial og en energikilde i form av ATP15. For eksempel, når membranpotensialet er spredt, kan proteinkinase PINK1 ikke tas opp av organellen, og dette fører til fosforyleringssignaler som utløser utbruddet av organellets nedbrytning gjennom en vei som kalles mitophagy16,17. Under lignende omstendigheter, når importen hindres, kan ikke proteinet ATF5 komme inn i organellen, og det translokaliseres deretter til kjernen, hvor det fungerer som en transkripsjonsfaktor for oppregulering av UPR-genuttrykk18,19. Dermed kan måling av proteinimporteffektivitet gi omfattende innsikt i organellets helse, mens genuttrykksresponsen kan brukes til å indikere graden av retrograd signalering til kjernen.
Til tross for sin åpenbare betydning for biogenesen av mitokondrier og for cellulær helse generelt, er importveien i pattedyr mitokondrier bemerkelsesverdig undervurdert. I denne rapporten beskriver vi de spesifikke trinnene som er involvert i måling av import av forløperproteiner til skjelettmuskulatur mitokondrier og gir data for å illustrere importsystemets adaptive respons på endringer i muskler og disuse, noe som illustrerer proteinimportens bidrag til den adaptive plastisiteten til skjelettmuskulaturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrier er unikt avhengige av uttrykket og koordineringen av både nukleære og mitokondriegenomer for deres syntese og ekspansjon i celler. Imidlertid koder atomgenomet det store flertallet (99%) av mitokondrieproteomet, og dette understreker betydningen av proteinimportmaskineriet for å støtte mitokondriebiogenese. Import fungerer også som en viktig signalhendelse, da manglende import kan fremme initiering av utfoldet proteinrespons og / eller mitophagy15,16,26.<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss fra Washington School of Medicine, og Dr.M.T. Ryan fra La Trobe University for de opprinnelige donasjonene av uttrykksplasmider som ble brukt til denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) til D. A. Hood. D. A. Hood er også innehaver av en Canada Research Chair i Cell Physiology.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
