Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur
Summary
Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselorganellen, die eine hohe phänotypische Plastizität in der Skelettmuskulatur aufweisen. Der Import von Proteinen aus dem Zytosol ist ein kritischer Weg für die Organellenbiogenese, der für die Expansion des Retikulums und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion unerlässlich ist. Daher dient der Proteinimport als Barometer für die Zellgesundheit.
Abstract
Mitochondrien sind wichtige metabolische und regulatorische Organellen, die die Energieversorgung sowie die allgemeine Gesundheit der Zelle bestimmen. In der Skelettmuskulatur existieren Mitochondrien in einer Reihe komplexer Morphologien, die von kleinen ovalen Organellen bis zu einem breiten, retikulumartigen Netzwerk reichen. Zu verstehen, wie sich das mitochondriale Retikulum als Reaktion auf verschiedene Reize wie Veränderungen des Energiebedarfs ausdehnt und entwickelt, ist seit langem ein Forschungsthema. Ein Schlüsselaspekt dieses Wachstums oder der Biogenese ist der Import von Vorläuferproteinen, die ursprünglich vom Kerngenom kodiert, im Zytosol synthetisiert und in verschiedene mitochondriale Unterkompartimente transloziert wurden. Mitochondrien haben einen ausgeklügelten Mechanismus für diesen Importprozess entwickelt, der viele selektive innere und äußere Membrankanäle umfasst, die als Proteinimportmaschinerie (PIM) bekannt sind. Der Import in das Mitochondrium hängt vom lebensfähigen Membranpotential und der Verfügbarkeit von Organellen-abgeleitetem ATP durch oxidative Phosphorylierung ab. Daher kann seine Messung als Maß für die Gesundheit der Organellen dienen. Das PIM weist auch eine hohe adaptive Plastizität in der Skelettmuskulatur auf, die eng an den Energiestatus der Zelle gekoppelt ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Bewegungstraining die Importkapazität erhöht, während Muskelmangel sie reduziert, was mit Veränderungen der Marker des mitochondrialen Inhalts zusammenfällt. Obwohl der Proteinimport ein kritischer Schritt in der Biogenese und Expansion der Mitochondrien ist, ist der Prozess in der Skelettmuskulatur nicht weit verbreitet. Daher beschreibt dieses Papier, wie isolierte und voll funktionsfähige Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur verwendet werden können, um die Proteinimportkapazität zu messen, um ein besseres Verständnis der beteiligten Methoden und eine Wertschätzung der Bedeutung des Weges für den Organellenumsatz in Bewegung, Gesundheit und Krankheit zu fördern.
Introduction
Mitochondrien sind Organellen, die in komplexen Morphologien in verschiedenen Zelltypen vorkommen und eine zunehmende Anzahl von Funktionen besitzen, die für die Zellgesundheit entscheidend sind. Als solche können sie nicht mehr nur auf energieerzeugende Organellen reduziert werden. Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselregulatoren, Determinanten des Zellschicksals und Signalknotenpunkte, deren Funktionen als nützliche Indikatoren für die allgemeine Zellgesundheit dienen können. In Skelettmuskelzellen zeigen elektronenmikroskopische Studien das Vorhandensein von geografisch unterschiedlichen subsarkoplemen (SS) und intermyofibrillaren (IMF) Mitochondrien, die einen Grad an Konnektivität aufweisen1,2,3,4, der heute als hochdynamisch und anpassungsfähig an Veränderungen der Skelettmuskelaktivität sowie mit Alter und Krankheit anerkannt ist. Mitochondrialer Gehalt und Funktion im Muskel können auf vielfältige Weise beurteilt werden5,6, und traditionelle Methoden der Organellenisolierung wurden angewendet, um die respiratorischen und enzymatischen Kapazitäten (Vmax) der Mitochondrien besser zu verstehen, die sich vom Einfluss des zellulären Milieus unterscheiden7,8. Insbesondere haben diese traditionellen Methoden subtile biochemische Unterschiede zwischen Mitochondrien aufgedeckt, die aus subsarkoplemalen und intermyofibrillären Regionen isoliert wurden, was mögliche funktionelle Auswirkungen auf den Stoffwechsel in diesen subzellulären Regionen widerlegt8,9,10,11.
Die Biogenese der Mitochondrien ist einzigartig, da sie den Beitrag von Genprodukten sowohl aus der kernigen als auch aus der mitochondrialen DNA erfordert. Die überwiegende Mehrheit davon stammt jedoch aus dem Zellkern, da die mtDNA-Transkription nur zur Synthese von 13 Proteinen führt. Da Mitochondrien normalerweise >1000 Proteine umfassen, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, erfordert die Biogenese der Organelle ein streng reguliertes Mittel zum Import und Zusammenbau von Vorläuferproteinen aus dem Zytosol in die verschiedenen mitochondrialen Unterkompartimente, um eine ordnungsgemäße Stöchiometrie und Funktion aufrechtzuerhalten12,13. Kernkodierte Proteine, die für Mitochondrien bestimmt sind, tragen normalerweise eine mitochondriale Zielsequenz (MTS), die sie auf die Organelle abstößt und ihre subkompartimentale Lokalisierung erleichtert. Die meisten matrixgebundenen Proteine enthalten ein spaltbares N-terminales MTS, während diejenigen, die für die äußere oder innere mitochondriale Membran bestimmt sind, normalerweise interne Zieldomänen haben14. Der Importprozess wird von einer Reihe verschiedener Kanäle durchgeführt, die mehrere Wege für den Eintritt in die Organelle13 bieten. Der Translokase-Komplex der äußeren Membran (TOM) transportiert Vorläufer aus dem Zytosol in den Intermembranraum, wo sie vom Translocase-Komplex der inneren Membran (TIM) erkannt werden. Dieser Komplex ist verantwortlich für den Import von kernkodierten Vorläufern in die Matrix, wo Proteasen die N-terminale Zielvorsequenz spalten. Proteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, können durch den TOM-Komplex direkt in diese Membran eingefügt werden, während diejenigen, die für die innere Membran bestimmt sind, durch ein TIM-Protein, speziell TIM22, eingefügt werden. Nach ihrem Import werden Proteine von residenten Proteasen und Chaperonen weiterverarbeitet und verbinden sich oft zu größeren Komplexen, wie sie in der Elektronentransportkette vorkommen.
Der mitochondriale Proteinimport selbst dient auch als Messung der mitochondrialen Gesundheit, da dieser Prozess auf dem Vorhandensein von Membranpotential und einer Energiequelle in Form von ATP15 beruht. Wenn beispielsweise das Membranpotential dissipiert wird, kann die Proteinkinase PINK1 nicht von der Organelle aufgenommen werden, und dies führt zu Phosphorylierungssignalen, die den Beginn des Abbaus der Organelle über einen Weg namens Mitophagie auslösen16,17. Unter ähnlichen Umständen kann das Protein ATF5, wenn der Import behindert wird, nicht in die Organelle gelangen und transloziert anschließend in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor für die Hochregulierung der UPR-Genexpression dient18,19. So kann die Messung der Proteinimporteffizienz einen umfassenden Einblick in die Gesundheit der Organelle geben, während die Genexpressionsantwort verwendet werden kann, um den Grad der retrograden Signalübertragung an den Zellkern anzuzeigen.
Trotz seiner offensichtlichen Bedeutung für die Biogenese der Mitochondrien und für die Zellgesundheit im Allgemeinen ist der Importweg in den Mitochondrien von Säugetieren bemerkenswert wenig erforscht. In diesem Bericht beschreiben wir die spezifischen Schritte zur Messung des Imports von Vorläuferproteinen in die Mitochondrien der Skelettmuskulatur und liefern Daten, um die adaptive Reaktion des Importsystems auf Muskelveränderungen und Nichtgebrauch zu veranschaulichen und den Beitrag des Proteinimports zur adaptiven Plastizität der Skelettmuskulatur zu veranschaulichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondrien sind in einzigartiger Weise von der Expression und Koordination sowohl des nuklearen als auch des mitochondrialen Genoms für ihre Synthese und Expansion innerhalb von Zellen abhängig. Das Kerngenom kodiert jedoch für die überwiegende Mehrheit (99%) des mitochondrialen Proteoms, was die Bedeutung der Proteinimportmaschinerie für die Unterstützung der mitochondrialen Biogenese unterstreicht. Der Import dient auch als wichtiges Signalereignis, da ein Nichtimport die Initiierung der entfalteten Proteinant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. G.C. Shore von der McGill University, Dr. A. Strauss von der Washington School of Medicine und Dr.M.T. Ryan von der La Trobe University für die ursprünglichen Spenden von Expressionsplasmiden, die für diese Forschung verwendet wurden. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) an D. A. Hood unterstützt. D. A. Hood ist auch Inhaber eines kanadischen Forschungslehrstuhls für Zellphysiologie.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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