Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën
Summary
Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie. Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.
Abstract
Mitochondriën zijn belangrijke metabole en regulerende organellen die de energievoorziening en de algehele gezondheid van de cel bepalen. In de skeletspieren bestaan mitochondriën in een reeks complexe morfologieën, variërend van kleine ovale organellen tot een breed, reticulumachtig netwerk. Begrijpen hoe het mitochondriale reticulum zich uitbreidt en ontwikkelt als reactie op diverse stimuli zoals veranderingen in de energievraag, is al lang een onderwerp van onderzoek. Een belangrijk aspect van deze groei, of biogenese, is de import van precursoreiwitten, oorspronkelijk gecodeerd door het nucleaire genoom, gesynthetiseerd in het cytosol en getransloceerd in verschillende mitochondriale subcompartimenten. Mitochondriën hebben een geavanceerd mechanisme ontwikkeld voor dit importproces, waarbij veel selectieve binnen- en buitenmembraankanalen betrokken zijn, bekend als de eiwitimportmachinerie (PIM). Import in het mitochondrion is afhankelijk van levensvatbare membraanpotentiaal en de beschikbaarheid van organel-afgeleide ATP door oxidatieve fosforylering. Daarom kan de meting ervan dienen als een maat voor de gezondheid van organellen. De PIM vertoont ook een hoge mate van adaptieve plasticiteit in de skeletspieren die nauw verbonden is met de energiestatus van de cel. Van oefeningstraining is bijvoorbeeld aangetoond dat het de importcapaciteit verhoogt, terwijl spierontwensen deze vermindert, samenvallend met veranderingen in markers van mitochondriale inhoud. Hoewel eiwitimport een cruciale stap is in de biogenese en uitbreiding van mitochondriën, wordt het proces niet op grote schaal bestudeerd in skeletspieren. Dit artikel schetst dus hoe geïsoleerde en volledig functionele mitochondriën uit skeletspieren kunnen worden gebruikt om de eiwitimportcapaciteit te meten om een beter begrip van de betrokken methoden en een waardering van het belang van de route voor organelomzet bij lichaamsbeweging, gezondheid en ziekte te bevorderen.
Introduction
Mitochondriën zijn organellen die bestaan in complexe morfologieën in verschillende celtypen en waarvan wordt erkend dat ze een toenemend scala aan functies bezitten die van cruciaal belang zijn voor de cellulaire gezondheid. Als zodanig kunnen ze niet langer alleen worden gereduceerd tot energieproducerende organellen. Mitochondriën zijn belangrijke metabole regulatoren, determinanten van het lot van cellen en signaleringshubs, waarvan de functies kunnen dienen als nuttige indicatoren voor de algehele cellulaire gezondheid. In skeletspiercellen onthullen elektronenmicroscopiestudies de aanwezigheid van geografisch verschillende subsarcolemmale (SS) en intermyofibrillaire (IMF) mitochondriën, die een mate van connectiviteit vertonen1,2,3,4 waarvan nu wordt erkend dat ze zeer dynamisch zijn en zich kunnen aanpassen aan veranderingen in skeletspieractiviteitsniveaus, evenals met leeftijd en ziekte. Mitochondriale inhoud en functie in spieren kunnen op verschillende manieren worden beoordeeld5,6, en traditionele methoden van organelisolatie zijn toegepast om de ademhalings- en enzymatische capaciteiten (Vmax) van mitochondriën beter te begrijpen die verschillen van de invloed van het cellulaire milieu7,8. In het bijzonder hebben deze traditionele methoden subtiele biochemische verschillen onthuld tussen mitochondriën geïsoleerd uit subsarcolemmale en intermyofibrillaire regio’s, wat mogelijke functionele implicaties voor het metabolisme in deze subcellulaire regio’s ligt8,9,10,11.
De biogenese van mitochondriën is uniek in het vereisen van de bijdrage van genproducten uit zowel nucleair als mitochondriaal DNA. De overgrote meerderheid hiervan is echter afgeleid van de kern, omdat mtDNA-transcriptie alleen leidt tot de synthese van 13 eiwitten. Aangezien mitochondriën normaal gesproken >1000 eiwitten bevatten die betrokken zijn bij diverse metabole routes, vereist biogenese van het organel een strak gereguleerd middel voor import en assemblage van precursoreiwitten uit het cytosol in de verschillende mitochondriale subcompartimenten om de juiste stoichiometrie en functie te behouden12,13. Nucleair gecodeerde eiwitten bestemd voor mitochondriën dragen normaal gesproken een mitochondriale targetingsequentie (MTS) die hen op het organel richt en hun subcompartimentale lokalisatie vergemakkelijkt. De meeste matrixgebonden eiwitten bevatten een splijtbare N-terminale MTS, terwijl die bestemd voor het buitenste of binnenste mitochondriale membraan meestal interne targetingdomeinen hebben14. Het importproces wordt uitgevoerd door een reeks verschillende kanalen die meerdere mogelijkheden bieden voor toegang tot het organel13. De translocase van het buitenmembraan (TOM) complex pendelt voorlopers van het cytosol naar de intermembraanruimte, waar ze worden herkend door de translocase van het binnenmembraan (TIM) complex. Dit complex is verantwoordelijk voor het importeren van nucleair gecodeerde precursoren in de matrix, waar proteasen de N-terminal splitsen en zich richten op presequence. Eiwitten bestemd voor het buitenmembraan kunnen rechtstreeks in dit membraan worden ingebracht via het TOM-complex, terwijl die bestemd voor het binnenmembraan worden ingebracht door een TIM-eiwit, met name TIM22. Na hun import worden eiwitten verder verwerkt door residente proteasen en chaperones en combineren ze vaak om grotere complexen te vormen, zoals die in de elektronentransportketen.
Mitochondriale eiwitimport zelf dient ook als een meting van mitochondriale gezondheid, omdat dit proces afhankelijk is van de aanwezigheid van membraanpotentiaal en een bron van energie in de vorm van ATP15. Wanneer bijvoorbeeld de membraanpotentiaal wordt gedissipeerd, kan eiwitkinase PINK1 niet door het organel worden opgenomen, en dit leidt tot fosforyleringssignalen die het begin van de afbraak van het organel veroorzaken via een route die mitofagie wordt genoemd16,17. Onder vergelijkbare omstandigheden, wanneer de import wordt belemmerd, kan het eiwit ATF5 het organel niet binnendringen en transloceert het vervolgens naar de kern, waar het dient als transcriptiefactor voor de up-regulatie van UPR-genexpressie18,19. Zo kan het meten van eiwitimportefficiëntie uitgebreid inzicht geven in de gezondheid van het organel, terwijl de genexpressierespons kan worden gebruikt om de mate van retrograde signalering naar de kern aan te geven.
Ondanks het duidelijke belang ervan voor de biogenese van mitochondriën en voor de cellulaire gezondheid in het algemeen, is de importroute in mitochondriën van zoogdieren opmerkelijk onderbelicht. In dit rapport beschrijven we de specifieke stappen die betrokken zijn bij het meten van de import van precursoreiwitten in mitochondriën van de skeletspieren en leveren we gegevens om de adaptieve reactie van het importsysteem op veranderingen in spieren en onbruik te illustreren, wat de bijdrage van de eiwitimport aan de adaptieve plasticiteit van skeletspieren illustreert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriën zijn uniek afhankelijk van de expressie en coördinatie van zowel het nucleaire als het mitochondriale genoom voor hun synthese en expansie in cellen. Het nucleaire genoom codeert echter voor de overgrote meerderheid (99%) van het mitochondriale proteoom, en dit onderstreept het belang van de eiwitimportmachinerie bij het ondersteunen van mitochondriale biogenese. Import dient ook als een belangrijke signaleringsgebeurtenis, omdat het niet importeren de initiatie van de ongevouwen eiwitrespons en / of mito…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. G.C. Shore van McGill University, Dr. A. Strauss van de Washington School of Medicine en Dr.M.T. Ryan van La Trobe University bedanken voor de originele donaties van expressieplasmiden die voor dit onderzoek werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) aan D.A. Hood. D. A. Hood is ook de houder van een Canada Research Chair in Cell Physiology.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
