هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.
الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) هي خلايا بطانية متخصصة تقع في الواجهة بين الدورة الدموية وحمة الكبد. LSECs لها مورفولوجيا متميزة تتميز بوجود fenestrae وغياب الغشاء السفلي. تلعب LSECs أدوارا أساسية في العديد من الاضطرابات المرضية في الكبد ، بما في ذلك خلل التنظيم الأيضي ، والالتهابات ، والتليف ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتسرطن. ومع ذلك ، لم يتم نشر سوى القليل حول عزل وتوصيف LSECs. هنا ، يناقش هذا البروتوكول عزل LSEC عن كل من الفئران الصحية وغير الكحولية لمرض الكبد الدهني (NAFLD). يعتمد البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر والخرز المغناطيسي والاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تميز هذه الدراسة LSECs باستخدام علامات محددة عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحدد السمات الظاهرية المميزة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. يمكن استخدام LSECs المعزولة بعد هذا البروتوكول للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبارات الالتصاق والنفاذية ، بالإضافة إلى الدراسات النهائية لمسار معين من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تجميع هذه LSECs أو استخدامها بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة omics بما في ذلك RNA-seq السائبة أو خلية واحدة ، والبروتينات أو الفوسفو ، وفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه باستخدام التسلسل (ATAC-seq) ، من بين أمور أخرى. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يدرسون اتصال LSECs مع خلايا الكبد الأخرى في الصحة والمرض ويسمح بفهم متعمق لدور LSECs في الآليات المسببة للأمراض لإصابات الكبد الحادة والمزمنة.
تبطن الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) جدران الجيوب الأنفية الكبدية وهي الخلايا غير المتنية الأكثر وفرة في الكبد1. تتميز LSECs عن الخلايا البطانية الشعرية الأخرى في أماكن أخرى من الجسم بوجود fenestrae وعدم وجود غشاء قبو كلاسيكي أو غشاء 2,3. وبالتالي ، تمتلك LSECs خصائص مظهرية وهيكلية مميزة تعزز نفاذيتها وقدرتها على الخلايا الداخلية للقضاء على مجموعة متنوعة من الجزيئات الكبيرة المتداولة ، بما في ذلك الدهون والبروتينات الدهنية. تلعب LSECs دورا محوريا في التداخل بين الخلايا المتنية وغير المتنية ، مثل الخلايا النجمية والخلايا المناعية. LSECs هي المفتاح في الحفاظ على توازن الكبد عن طريق الحفاظ على الخلايا النجمية وخلايا كوبفر في حالة هادئة4. تقوم LSECs بتعديل تكوين مجموعات الخلايا المناعية الكبدية عن طريق التوسط في الالتصاق والهجرة عبر البطانية لكريات الدم البيضاء المتداولة 5,6. أثناء إصابة الكبد الحادة والمزمنة7 ، بما في ذلك إصابة نقص التروية (IRI) 8 ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH)9 ، وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، تخضع LSECs لتغيرات في النمط الظاهري تعرف باسم الشعيرات الدموية التي تتميز بنزع الشعر وتشكيل الغشاء السفلي10. ترتبط هذه التغيرات المظهرية في LSECs بخلل LSECs واكتساب خصائص prothrombotic و proinflammatory و profibrogenic.
تم تطوير عدة طرق لعزل LSECs من كبد الفأر11. تعتمد بعض التقنيات على فصل الخلايا غير المتنية والخلايا المتنية متبوعة بالطرد المركزي بتدرج الكثافة لتنقية LSECs من الكسور غير المتني. الحد من هذه الطريقة هو وجود البلاعم الملوثة في الخطوات النهائية لعزل LSECs ، والتي يمكن أن تؤثر على نقاء LSECs المعزولة12. يعتمد هذا البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر و CD146 + الخرز المغناطيسي الاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تظهر LSECs المعزولة باستخدام هذه الطريقة نقاء عاليا ومورفولوجيا محفوظة وقابلية للحياة. هذه LSECs هي الأمثل للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبار النفاذية والالتصاق ، وكذلك الدراسات النهائية للمسارات ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، مع الاهتمام المتزايد بتوليد مجموعات البيانات الضخمة في كل من الأبحاث السريرية وعلوم الاكتشاف ، يمكن تجميع أو استخدام هذه LSECs عالية الجودة المعزولة من كل من الكبد الدهني الصحي والمريضة مع التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) أو غيرها من الحالات بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة الأوميكس والمقارنة بين الصحة والمرض13,14 . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام LSECs المعزولة لتطوير نماذج ثنائية الأبعاد وكذلك ثلاثية الأبعاد في المختبر مثل المواد العضوية لفك شفرة مسار الإشارات المنشط في LSECs واتصالها بين الخلايا مع خلايا الكبد الأخرى تحت محفزات ضارة مختلفة واستجابة لمختلف التدخلات العلاجية.
في المخطوطة الحالية ، نصف بروتوكولا لعزل LSEC عن كبد الفأر يتكون من تروية الكولاجيناز المكونة من خطوتين وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا اللاحق (MACS). يتكون هذا البروتوكول من الخطوات الثلاث التالية: (1) التروية من خلال الكهروضوئية مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم يليه مخزن مؤقت يحتوي على الكولاجينا…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة (1RO1DK122948 إلى SHI) وآلية منح NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 (DK084567). كما تم تقديم الدعم إلى KF من قبل زمالات البحوث الخارجية للجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS). نود أيضا أن نشيد بالدكتور غريغوري ج. غوريس وستيفن برونك على تصميمهما الأصلي وتحسينهما لجهاز تروية الكولاجيناز.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |