Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Summary

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Abstract

Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) sind spezialisierte Endothelzellen, die sich an der Schnittstelle zwischen dem Kreislauf und dem Leberparenchym befinden. LSECs haben eine ausgeprägte Morphologie, die durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer Basalmembran gekennzeichnet ist. LSECs spielen eine wesentliche Rolle bei vielen pathologischen Erkrankungen der Leber, einschließlich metabolischer Dysregulation, Entzündungen, Fibrose, Angiogenese und Karzinogenese. Über die Isolierung und Charakterisierung der LSECs wurde jedoch wenig veröffentlicht. Hier diskutiert dieses Protokoll die Isolierung von LSEC von gesunden und nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen (NAFLD) Mäusen. Das Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen zur Reinigung von LSECs. Diese Studie charakterisiert LSECs unter Verwendung spezifischer Marker durch Durchflusszytometrie und identifiziert die charakteristischen phänotypischen Merkmale durch Rasterelektronenmikroskopie. LSECs, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, können für funktionelle Studien, einschließlich Adhäsions- und Permeabilitätsassays, sowie für nachgelagerte Studien für einen bestimmten Signalweg von Interesse verwendet werden. Darüber hinaus können diese LSECs gepoolt oder einzeln verwendet werden, was unter anderem die Generierung von Multi-Omics-Daten ermöglicht, einschließlich RNA-seq-Bulk oder Einzelzell-, Proteomik- oder Phospho-Proteomik und Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierung (ATAC-seq). Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die die Kommunikation von LSECs mit anderen Leberzellen in Gesundheit und Krankheit untersuchen und ein tiefes Verständnis der Rolle von LSECs bei den pathogenen Mechanismen akuter und chronischer Leberschäden ermöglichen.

Introduction

Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) säumen die hepatischen Sinuswände und sind die am häufigsten vorkommenden nichtparenchymalen Zellen in der Leber¹. LSECs unterscheiden sich von anderen kapillaren Endothelzellen an anderer Stelle im Körper durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer klassischen Basalmembran oder eines Zwerchfells ^2,3. Daher besitzen die LSECs charakteristische phänotypische und strukturelle Eigenschaften, die ihre Permeabilität und endozytäre Fähigkeit zur Beseitigung einer Vielzahl von zirkulierenden Makromolekülen, einschließlich Lipiden und Lipoproteinen, verbessern. LSECs spielen eine zentrale Rolle im Crosstalk zwischen parenchymalen und nichtparenchymalen Zellen, wie Sternzellen und Immunzellen. LSECs sind der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Leberhomöostase, indem sie die Sternzellen und Kupffer-Zellen in einem Ruhezustand^{halten 4}. LSECs modulieren die Zusammensetzung der Populationen hepatischer Immunzellen, indem sie Adhäsion und transendotheliale Migration von zirkulierenden Leukozyten vermitteln ^5,6. Während der akuten und chronischen Leberschädigung⁷, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI)⁸, nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH)⁹ und hepatozellulärem Karzinom (HCC), unterliegen LSECs phänotypischen Veränderungen, die als Kapillarisierung bekannt sind und durch Defenestration und Bildung der Basalmembran¹⁰ gekennzeichnet sind. Diese phänotypischen Veränderungen in LSECs sind mit LSEC-Dysfunktion und dem Erwerb prothrombotischer, proinflammatorischer und profibrogener Eigenschaften verbunden.

Mehrere Methoden zur Isolierung von LSECs aus der Mausleber wurden entwickelt¹¹. Einige Techniken hängen von der Trennung von nichtparenchymalen und parenchymalen Zellen ab, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die LSECs von nichtparenchymalen Fraktionen zu reinigen. Die Einschränkung dieser Methode ist das Vorhandensein von kontaminierenden Makrophagen in den letzten Schritten der LSEC-Isolierung, die die Reinheit der isolierten GVECs^{beeinflussen könnten 12}. Dieses Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen durch ^{CD146 + –}Magnetkügelchen, um LSECs zu reinigen. Mit dieser Methode isolierte LSECs zeigen eine hohe Reinheit und konservierte Morphologie und Lebensfähigkeit. Diese LSECs sind optimal für funktionelle Studien, einschließlich Permeabilitäts- und Adhäsionsassays, sowie für nachgelagerte Studien für Pfade von Interesse. Mit dem wachsenden Interesse an der Generierung großer Datensätze sowohl in der klinischen Forschung als auch in der Entdeckungswissenschaft können diese hochwertigen LSECs, die sowohl aus gesunden als auch aus erkrankten Lebern mit nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH) oder anderen Erkrankungen isoliert wurden, gepoolt oder einzeln verwendet werden, was die Generierung von Multi-Omics-Daten und den Vergleich zwischen Gesundheit und Krankheit ermöglicht^13,14 . Darüber hinaus können die isolierten LSECs verwendet werden, um sowohl zweidimensionale als auch dreidimensionale In-vitro-Modelle wie Organoide zu entwickeln, um den aktivierten Signalweg in LSECs und ihre interzelluläre Kommunikation mit anderen Leberzellen unter verschiedenen schädlichen Reizen und als Reaktion auf verschiedene therapeutische Interventionen zu entschlüsseln.

Protocol

Tierprotokolle wurden durchgeführt, wie vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt. Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Die Mäuse wurden in einer temperaturgesteuerten 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklusanlage mit freiem Zugang zur Ernährung untergebracht. 1. Zubereitung einer kollagenbeschichteten Kulturschale oder eines Tellers Um 50 ml 0,02mol/lEssigsäure herzustellen…

Representative Results

Experimentelle Schaltpläne und Aufbau der Ausrüstung:In diesem Protokoll wurde die Mausleber mit einem geschlossenen Perfusionskreislauf verdaut, dann wurden nichtparenchymale Zellen und Hepatozyten durch langsame Zentrifugation bei 50 x g für 2 min getrennt. Primäre LSECs wurden unter Verwendung der Auswahl von CD146-Magnetperlen aus der nichtparenchymalen Fraktion isoliert. Die experimentellen Schaltpläne sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Kanüle wurd…

Discussion

Im aktuellen Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur LSEC-Isolierung aus der Mausleber, bestehend aus zweistufiger Kollagenase-Perfusion und anschließender magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS). Dieses Protokoll besteht aus den folgenden drei Schritten: (1) Perfusion durch die PV mit einem kalziumfreien Puffer, gefolgt von einem kollagenasehaltigen Puffer, um eine Leberzelldispersion zu erreichen; (2) Ausschluss von Hepatozyten mit langsamer Zentrifugation; und (3) MACS-basierte positive Selektion von LSECs …

Materials

2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07