हम बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री के इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्यक्ष संस्कृति, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति और एक्सपोजर संस्कृति के तीन तरीकों का परिचय देते हैं। ये इन विट्रो विधियां विवो सेल-इम्प्लांट इंटरैक्शन में अलग-अलग नकल करती हैं और विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का अध्ययन करने के लिए लागू की जा सकती हैं।
पिछले कई दशकों में, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों को बड़े पैमाने पर बायोमेडिकल अनुप्रयोगों जैसे कि आर्थोपेडिक, दंत चिकित्सा और क्रैनियोमैक्सिलोफेशियल प्रत्यारोपण के लिए खोजा गया है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल सामग्री को स्क्रीन करने के लिए, इन विट्रो सेल प्रतिक्रियाओं, साइटोकॉम्पैटिबिलिटी और साइटोटॉक्सिसिटी के संदर्भ में इन सामग्रियों का मूल्यांकन करना आवश्यक है। बायोमैटेरियल्स के मूल्यांकन में अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) मानकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, अधिकांश आईएसओ मानकों को मूल रूप से गैर-डिग्रेडेबल सामग्रियों की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए स्थापित किया गया था, इस प्रकार बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की स्क्रीनिंग के लिए सीमित मूल्य प्रदान किया गया था।
यह लेख तीन अलग-अलग संस्कृति विधियों का परिचय देता है और चर्चा करता है, अर्थात्, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि, और बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्री की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक्सपोजर संस्कृति विधि, जिसमें बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, सिरेमिक, धातुएं और उनके कंपोजिट शामिल हैं, विभिन्न सेल प्रकारों के साथ। अनुसंधान से पता चला है कि संस्कृति के तरीके बायोडिग्रेडेबल सामग्री के लिए सेल प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं क्योंकि उनकी गतिशील गिरावट इंटरफ़ेस पर और स्थानीय वातावरण में स्पैटिओटेम्पोरल अंतर को प्रेरित करती है। विशेष रूप से, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि प्रत्यारोपण पर सीधे बीज ति कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को प्रकट करती है; प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि प्रत्यारोपण के संपर्क में आने वाली स्थापित मेजबान कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करती है; और एक्सपोजर कल्चर विधि स्थापित मेजबान कोशिकाओं का मूल्यांकन करती है जो प्रत्यारोपण के साथ सीधे संपर्क में नहीं हैं, लेकिन प्रत्यारोपण गिरावट के कारण स्थानीय वातावरण में परिवर्तन से प्रभावित होते हैं।
यह लेख बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (बीएमएससी) के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इन तीन संस्कृति विधियों के उदाहरण प्रदान करता है। यह यह भी वर्णन करता है कि फसल, मार्ग, संस्कृति, बीज, ठीक, दाग, कोशिकाओं को चिह्नित करना, और पोस्टकल्चर मीडिया और सामग्रियों का विश्लेषण कैसे करना है। इस लेख में वर्णित इन विट्रो विधियां इन विवो वातावरण के विभिन्न परिदृश्यों की नकल करती हैं, विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए विभिन्न बायोमैटेरियल्स के इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी परीक्षण की प्रयोज्यता और प्रासंगिकता को विस्तृत करती हैं।
दशकों से, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और बायोमेडिकल अनुप्रयोगों जैसे ऑर्थोपेडिक 1,2, डेंटल 3,4 और क्रैनियोमैक्सिलोफेशियल 5 अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है। स्थायी प्रत्यारोपण और सामग्रियों के विपरीत, बायोडिग्रेडेबल धातुओं, सिरेमिक, पॉलिमर, और उनके कंपोजिट धीरे-धीरे शारीरिक वातावरण में विभिन्न रासायनिक प्रतिक्रियाओं के माध्यम से समय के साथ शरीर में खराब हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, मैग्नीशियम (Mg) मिश्र धातु1,6,7 और जस्ता (Zn) मिश्र धातु8,9 जैसे बायोडिग्रेडेबल धातुएं हड्डी निर्धारण उपकरणों के लिए आशाजनक सामग्री हैं। उनकी biodegradability हड्डी उपचार के बाद प्रत्यारोपण को हटाने के लिए माध्यमिक सर्जरी के लिए आवश्यकता को समाप्त कर सकता है। कैल्शियम फॉस्फेट सीमेंट (CPCs) जैसे बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक्स ने पर्क्यूटेनियस किफोप्लास्टी 10 में ऑस्टियोपोरोटिक कशेरुका संपीड़न फ्रैक्चर के उपचार के लिए रोमांचक क्षमता दिखाई है। सीपीसी फ्रैक्चर कशेरुक शरीर के लिए यांत्रिक समर्थन प्रदान करते हैं और फ्रैक्चर ठीक होने के बाद धीरे-धीरे नीचा दिखाते हैं।
बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, जैसे कि कुछ पॉलीसेकेराइड और पॉलिएस्टर, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए भी व्यापक रूप से खोजा गया है। उदाहरण के लिए, एक बायोडिग्रेडेबल पॉलीसेकेराइड के रूप में चिटोसन हाइड्रोजेल ने संक्रमण को रोकने और त्वचा के ऊतकों को पुनर्जीवित करने के लिए अपनी क्षमताओं का प्रदर्शन किया है। पॉली-एल-लैक्टिक एसिड (पीएलएलए), पॉली (ग्लाइकोलिक एसिड) (पीजीए), और पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए 2 डी या 3 डी झरझरा मचानों को बनाने के लिए पॉलिएस्टर का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है12,13,14। इसके अलावा, समग्र सामग्री धातुओं, सिरेमिक और पॉलिमर के दो या दो से अधिक चरणों को एकीकृत करने के लिए जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उन्नत कार्य प्रदान करने के लिए15,16,17। उदाहरण के लिए, पीएलजीए और कैल्शियम फॉस्फेट कंपोजिट का उपयोग खोपड़ी की हड्डी के दोषों की मरम्मत जैसे अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल मचान बनाने के लिए किया जा सकता है। ये बायोडिग्रेडेबल मचान और प्रत्यारोपण कोशिकाओं और ऊतकों के विकास का समर्थन और बढ़ावा दे सकते हैं और फिर समय के साथ धीरे-धीरे शरीर में नीचा दिखा सकते हैं।
जैसा कि पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है, विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों में विभिन्न गिरावट तंत्र, उत्पाद और दरें हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, मैग्नीशियम मिश्र धातु, जैसे Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, और Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinc (AZ91)20, पानी के साथ प्रतिक्रिया करके अवक्रमित होते हैं, और उनके गिरावट उत्पादों में मुख्य रूप से Mg2 + आयन, OH– आयन, H2 गैस और खनिज जमाव शामिल हैं। बायोडिग्रेडेबल धातुओं के लिए गिरावट की दर उनकी विभिन्न रचनाओं, ज्यामिति और गिरावट के वातावरण के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, Cipriano et al.19 ने बताया कि ZSr41 तारों (Ø1.1 × 15 मिमी) ने 85% द्रव्यमान खो दिया, जबकि एक ही ज्यामिति वाले शुद्ध एमजी तारों ने 47 दिनों के लिए चूहे के टिबिया में प्रत्यारोपित होने के बाद 40% द्रव्यमान खो दिया। बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक सामग्री जैसे कि हाइड्रॉक्सीएपेटाइट (एचए) और β-ट्राइकैल्शियम फॉस्फेट (β-टीसीपी) समाधान-संचालित बाह्य कोशिकीय तरल विघटन के माध्यम से नीचा दिखा सकते हैं या छोटे कणों में टूट सकते हैं और फिर बाह्य कोशिकीय तरल विघटन और सेल-मध्यस्थता अवशोषण प्रक्रियाओं दोनों के माध्यम से नीचा दिखा सकते हैं। इन कैल्शियम फॉस्फेट-आधारित सिरेमिक के क्षरण उत्पादों में Ca2 + आयन, (PO4) 3- आयन, OH– आयन, और खनिज जमाव शामिल हो सकते हैं21। कैल्शियम फॉस्फेट सिरेमिक के लिए गिरावट की दर उनके क्रिस्टल संरचनाओं से काफी प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, वैन Blitterswijk et al.22 ने बताया कि 40 vol.% माइक्रोपोर के साथ एचए ने कोई द्रव्यमान नहीं खोया, जबकि 40 vol.% माइक्रोपोर के साथ β-TCP ने 3 महीने के लिए खरगोशों के टिबिया में प्रत्यारोपित होने के बाद 30 ± 4% द्रव्यमान खो दिया। PLGA14,23 जैसे पॉलिमर पानी की उपस्थिति में एस्टर लिंकेज के हाइड्रोलिसिस के कारण खराब हो सकते हैं, और गिरावट उत्पादों में मुख्य रूप से लैक्टिक और ग्लाइकोलिक एसिड शामिल हैं। पीएलजीए 50/50 के लिए एक महीने और पीएलजीए 95/5 को पूर्ण गिरावट प्राप्त करने में कई महीने लग सकते हैं।
सेल प्रतिक्रिया और cytocompatibility परीक्षण मूल्यांकन और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इन biodegradable प्रत्यारोपण सामग्री स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन (आईएसओ) के वर्तमान मानक, जैसे कि आईएसओ 10993-5: 2009 “चिकित्सा उपकरणों का जैविक मूल्यांकन- इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी के लिए भाग 5 परीक्षण”, शुरू में विट्रो 25 में टीआई मिश्र धातुओं और सीआर-को मिश्र धातुओं जैसे गैर-ग्रेडेबल बायोमैटेरियल्स की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। विशेष रूप से, आईएसओ 10993-5: 2009 केवल निकालने, प्रत्यक्ष संपर्क और अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षणों के इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षणों को कवर करता है। निकालने के परीक्षण में, अर्क को निष्कर्षण तरल पदार्थों में नमूने डुबोकर तैयार किया जाता है जैसे कि सीरम और शारीरिक खारा समाधानों के साथ संस्कृति मीडिया मानक समय और तापमान की स्थिति में से एक के तहत। एकत्र अर्क या कमजोर पड़ने को तब साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति में जोड़ा जाता है। प्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण के लिए, नमूना और कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क स्थापित (पालन) सेल परत पर परीक्षण नमूने को रखकर प्राप्त किया जाता है। अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण में, सीरम और पिघले हुए अगर वाले संस्कृति मीडिया को स्थापित कोशिकाओं को कवर करने के लिए पाइप किया जाता है। नमूना तो एक फिल्टर के साथ या बिना solidified आगर परत पर रखा जाता है.
आईएसओ मानकों ने विट्रो में बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का मूल्यांकन करने के लिए लागू होने पर कुछ सीमाएं दिखाई हैं। गैर-विकासीय सामग्रियों के विपरीत, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के क्षरण व्यवहार गतिशील होते हैं और एक अलग समय पर या विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों (जैसे, तापमान, आर्द्रता, मीडिया संरचना और सेल प्रकार) में बदल सकते हैं। निकालने का परीक्षण केवल सामग्री के अवक्रमण उत्पादों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करता है और नमूना गिरावट की गतिशील प्रक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं करता है। आईएसओ मानक के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण दोनों ही स्थापित कोशिकाओं और नमूनों के बीच बातचीत की विशेषता है। इसके अलावा, अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण में, सामग्री और कोशिकाएं विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट में होती हैं जो विवो वातावरण में प्रतिबिंबित नहीं होती हैं और बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के गतिशील क्षरण पर कब्जा नहीं करती हैं।
इस लेख का उद्देश्य वर्तमान आईएसओ मानकों में वर्णित विधियों की उपर्युक्त सीमाओं को संबोधित करने के लिए विभिन्न बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्रियों के लिए साइटोकंपैटिबिलिटी परीक्षण विधियों को पेश करना और चर्चा करना है। इस आलेख में प्रस्तुत विधियाँ प्रत्यारोपण सामग्री के गतिशील अवक्रमण व्यवहार और विवो में सेल-सामग्री इंटरैक्शन की विभिन्न परिस्थितियों पर विचार करती हैं। विशेष रूप से, यह लेख तीन साइटोकॉम्पैटिबिलिटी परीक्षण विधियां प्रदान करता है, अर्थात् प्रत्यक्ष संस्कृति, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति, और विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के लिए एक्सपोजर संस्कृति, जिसमें बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, सिरेमिक, धातुएं और चिकित्सा प्रत्यारोपण अनुप्रयोगों के लिए उनके कंपोजिट शामिल हैं।
प्रत्यक्ष संस्कृति विधि में, संस्कृति मीडिया में निलंबित कोशिकाओं को सीधे नमूनों पर बीज दिया जाता है, इस प्रकार नई बीजित कोशिकाओं और प्रत्यारोपण के बीच बातचीत का मूल्यांकन किया जाता है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति में, नमूनों को शरीर में स्थापित मेजबान कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण की बातचीत की नकल करने के लिए सीधे स्थापित सेल परत पर रखा जाता है। एक्सपोजर संस्कृति में, नमूनों को उनके संबंधित अच्छी तरह से आवेषण में रखा जाता है और फिर स्थापित कोशिकाओं के साथ संस्कृति कुओं में पेश किया जाता है, जो प्रत्यारोपण गिरावट से प्रेरित स्थानीय वातावरण में परिवर्तन के लिए स्थापित कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की विशेषता है जब उनका प्रत्यारोपण के साथ कोई सीधा संपर्क नहीं होता है। प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधियां एक ही संस्कृति में प्रत्यारोपण सामग्री के संपर्क में प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से कोशिकाओं का मूल्यांकन करती हैं। एक्सपोजर संस्कृति अप्रत्यक्ष रूप से एक ही संस्कृति में एक निर्धारित दूरी के भीतर प्रत्यारोपण सामग्री के संपर्क में कोशिकाओं को अच्छी तरह से दर्शाती है।
यह लेख विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों और मॉडल कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के लिए साइटोकंपैटिबिलिटी परीक्षण का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करता है, अर्थात, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (बीएमएससी)। प्रोटोकॉल में कोशिकाओं की कटाई, खेती, सीडिंग, फिक्सिंग, धुंधला और इमेजिंग शामिल है, साथ ही पोस्टकल्चर सामग्री और मीडिया के विश्लेषण के साथ, जो विभिन्न प्रकार की बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्री और सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं। ये विधियां सेल प्रतिक्रियाओं और विट्रो में साइटोकंपैटिबिलिटी के संदर्भ में विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हैं।
विवो में अनुप्रयोगों के विभिन्न पहलुओं के लिए ब्याज के बायोमैटेरियल्स की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न सेल संस्कृति विधियों का उपयोग किया जा सकता है। यह लेख ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी पुरस्कार 1512764 और एनएसएफ पीआईआरई 1545852), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच एनआईडीसीआर 1R03DE028631), कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूसी) रीजेंट्स संकाय विकास फैलोशिप, और अनुसंधान बीज अनुदान (हुइनान लियू) पर समिति, और यूसी-रिवरसाइड शोध प्रबंध अनुसंधान अनुदान (जियाजिया लिन) से वित्तीय सहायता की सराहना की। लेखकों ने XRD उपकरणों के उपयोग के लिए SEM / EDS और डॉ पेरी चेउंग के उपयोग के लिए यूसी-रिवरसाइड में उन्नत माइक्रोस्कोपी और माइक्रोएनालिसिस (CFAMM) के लिए केंद्रीय सुविधा की सराहना की। लेखक भी आंशिक संपादन के लिए थान Vy गुयेन और Queenie Xu की सराहना करते हैं। लेखक भी वीडियो के लिए कथन रिकॉर्ड करने के लिए सिंडी ली को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस लेख में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष, या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन या राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के विचारों को प्रतिबिंबित करें।
10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
18 G needle | BD | 305196 | |
25½ G needle | BD | 305122 | |
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
Optical microscope | VWR | VistaVision | |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
pH meter | VWR | model SB70P | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
surgical blade | VWR | 76353-728 | |
Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
Transwell inserts | Corning | 3460 | |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |