체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법
Summary
우리는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위해 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양의 세 가지 방법을 소개합니다. 이러한 시험관 내 방법은 상이한 생체내 세포-임플란트 상호작용을 모방하고 다양한 생분해성 물질을 연구하는데 적용될 수 있다.
Abstract
지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생체의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해서는 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다. 국제 표준화기구 (ISO) 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비분해성 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 확립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다.
이 기사에서는 세 가지 다른 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 그 복합체를 포함한 생분해 성 임플란트 재료의 시험관 내 세포 적합성을 평가하기위한 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다. 연구에 따르면 배양 방법은 동적 분해가 계면과 지역 환경에서 시공간 차이를 유도하기 때문에 생분해성 물질에 대한 세포 반응에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 구체적으로, 직접 배양 방법은 임플란트에 직접 시딩된 세포의 반응을 드러낸다; 직접 노출 배양 방법은 임플란트와 접촉하는 확립 된 숙주 세포의 반응을 해명합니다. 노출 배양 방법은 임플란트와 직접 접촉하지는 않지만 임플란트 분해로 인한 국소 환경의 변화에 의해 영향을받는 확립 된 숙주 세포를 평가합니다.
이 기사에서는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용을 연구하기 위한 이러한 세 가지 배양 방법의 예를 제공합니다. 또한 수확, 계대, 배양, 종자, 고정, 염색, 세포 특성화 및 배양 후 배지 및 재료 분석 방법을 설명합니다. 이 기사에서 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학적 응용을 위한 상이한 생체재료의 시험관내 세포적합성 시험의 적용가능성 및 관련성을 넓힌다.
Introduction
수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과1,2, dental3,4 및 craniomaxillofacial5 응용 분야와 같은 생물 의학 응용 분야에서 광범위하게 연구되고 사용되었습니다. 영구 임플란트 및 재료와 달리 생분해 성 금속, 세라믹, 폴리머 및 그 복합체는 생리 환경에서 다양한 화학 반응을 통해 시간이 지남에 따라 체내에서 점차 분해됩니다. 예를 들어, 마그네슘 (Mg) 합금1,6,7 및 아연 (Zn) 합금8,9와 같은 생분해 성 금속은 뼈 고정 장치의 유망한 재료입니다. 그들의 생분해성은 뼈 치유 후 임플란트를 제거하기 위해 이차 수술의 필요성을 제거 할 수 있습니다. 인산칼슘 시멘트(CPCs)와 같은 생분해성 세라믹은 경피적 척추성형술에서 골다공증 척추 압박 골절의 치료에 대한 흥미로운 잠재력을 보여주었다10. CPC는 골절 된 척추 신체에 기계적 지원을 제공하고 골절이 치유 된 후 점차적으로 저하됩니다.
일부 다당류 및 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머도 생물 의학 응용 분야에서 널리 탐구되었습니다. 예를 들어, 생분해성 다당류로서의 키토산 하이드로젤은 감염을 예방하고 피부 조직을 재생시키는 능력을 나타내었다11. 폴리-L-락트산(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA) 및 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)은 조직 공학 응용을 위한 2D 또는 3D 다공성 스캐폴드를 제조하기 위한 폴리에스테르로 널리 연구되어 있다12,13,14. 또한, 복합 재료는 금속, 세라믹 및 폴리머의 두 개 이상의 단계를 통합하여 광범위한 생물 의학 응용 분야에 고급 기능을 제공합니다15,16,17. 예를 들어, PLGA 및 인산칼슘 복합체는 두개골 뼈 결함 복구와 같은 용도를 위해 생분해성 스캐폴드를 제조하는데 사용될 수 있다18. 이러한 생분해성 스캐폴드와 임플란트는 세포와 조직의 성장을 지원하고 촉진한 다음 시간이 지남에 따라 신체에서 점진적으로 분해될 수 있습니다.
보충 표 1에 나타낸 바와 같이, 상이한 생분해성 물질은 다양한 분해 메카니즘, 생성물 및 비율을 가질 수 있다. 예를 들어, 마그네슘 합금, 예컨대 Mg-2 wt% Zn-0.5 wt% Ca(ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, 및 Mg-9 wt% Al-1 wt% 아연 (AZ91)20, 물과 반응하여 분해되고, 이들의 분해 생성물은 주로 Mg2+ 이온, OH-이온, H2 가스, 및 광물 증착을 포함한다. 생분해성 금속의 분해 속도는 다양한 조성, 기하학적 및 분해 환경에 따라 다릅니다. 예를 들어, Cipriano et al.19는 ZSr41 와이어 (Ø1.1 × 15mm)가 85 %의 질량을 잃는 반면 동일한 기하학적 구조를 가진 순수한 Mg 와이어는 47 일 동안 쥐 경골에 이식 된 후 40 % 질량을 잃었다고보고했습니다. 하이드록시아파타이트(HA) 및 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP)와 같은 생분해성 세라믹 물질은 용액 구동 세포외 액체 용해를 통해 분해되거나 작은 입자로 분해된 후 세포외 액체 용해 및 세포 매개 재흡수 과정을 통해 분해될 수 있습니다. 이들 인산칼슘계 세라믹의 분해 생성물은 Ca2+ 이온, (PO4)3-이온, OH–이온, 및 미네랄 침착21을 포함할 수 있다. 인산 칼슘 세라믹의 분해 속도는 결정 구조에 의해 크게 영향을받습니다. 예를 들어, Van Blitterswijk et al.22는 40 vol.% 미세 기공을 가진 HA가 질량을 잃지 않는 반면, 40 vol.% 미세 기공을 가진 β-TCP는 토끼의 경골에 3 개월 동안 이식 된 후 30 ± 4 % 질량을 잃었다고보고했다. PLGA14,23과 같은 중합체는 물의 존재 하에 에스테르 결합의 가수분해로 인해 분해될 수 있고, 분해 생성물은 주로 락트산 및 글리콜산을 포함한다. PLGA 50/50의 경우 한 달이 걸리고 PLGA 95/5가 완전한 성능 저하를 달성하는 데 몇 달이 걸릴 수 있습니다24.
세포 반응 및 세포 적합성 테스트는 생물 의학 응용 분야에서 이러한 생분해성 임플란트 재료를 평가하고 스크리닝하는 데 중요합니다. 그러나 ISO 10993-5:2009 “의료기기의 생물학적 평가-시험관내 세포독성에 대한 Part 5 시험”과 같은 국제 표준화기구 (ISO)의 현재 표준은 처음에는 시험관 내 Ti 합금 및 Cr-Co 합금과 같은 비분해성 생체 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 특히, ISO 10993-5:2009는 추출물의 시험관내 세포독성 시험, 직접 접촉 및 간접 접촉 시험만을 다룹니다. 추출물 시험에서, 추출물은 표준 시간 및 온도 조건 중 하나 하에서 혈청 및 생리 식염수로 배양 배지와 같은 추출 유체에 샘플을 침지함으로써 제조된다. 수집된 추출물 또는 희석액은 세포 독성을 연구하기 위해 세포 배양물에 첨가된다. 직접 접촉 시험을 위해, 샘플과 세포 사이의 직접 접촉은 시험 샘플을 확립된(adherd) 세포층 상에 배치함으로써 달성된다. 간접 접촉 시험에서, 혈청 및 용융된 한천을 함유하는 배양 배지는 확립된 세포를 덮기 위해 피펫팅된다. 이어서, 샘플을 필터 유무에 관계없이 응고된 한천 층 상에 놓는다.
ISO 표준은 시험관 내에서 생분해성 물질을 평가하기 위해 적용될 때 몇 가지 한계를 보여주었습니다. 비분해성 물질과는 달리, 생분해성 물질의 분해 거동은 동적이며, 상이한 시간 또는 다양한 환경 조건(예를 들어, 온도, 습도, 배지 조성 및 세포 유형)에서 변할 수 있다. 추출물 시험은 물질의 분해 생성물의 세포독성만을 평가하고, 샘플 분해의 동적 과정을 반영하지 않는다. ISO 표준의 직접 및 간접 접촉 테스트는 확립 된 세포와 샘플 간의 상호 작용 만 특성화합니다. 더욱이, 간접 접촉 시험에서, 물질 및 세포는 생체내 환경을 반영하지 않고 생분해성 물질의 동적 분해를 포착하지 않는 상이한 미세환경에 있다.
이 기사의 목적은 현재 ISO 표준에 설명 된 방법의 위에서 언급 한 한계를 해결하기 위해 다양한 생분해 성 임플란트 재료에 대한 세포 적합성 테스트 방법을 소개하고 논의하는 것입니다. 이 기사에서 제시된 방법은 임플란트 재료의 동적 분해 거동과 생체 내에서 세포 – 물질 상호 작용의 다양한 상황을 고려합니다. 특히, 이 기사에서는 세 가지 세포 적합성 테스트 방법, 즉 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 의료용 임플란트 적용을 위한 복합 소재를 포함한 다양한 생분해성 물질에 대한 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 제공합니다.
직접 배양 방법에서, 배양 배지에 현탁된 세포는 샘플에 직접 시딩되고, 따라서 새로 시딩된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 평가한다. 직접 노출 배양에서, 샘플은 체내에서 확립된 숙주 세포와의 임플란트의 상호작용을 모방하기 위해 확립된 세포층 상에 직접 배치된다. 노출 배양에서, 샘플은 각각의 웰 인서트에 배치된 다음, 확립된 세포와 함께 배양 웰에 도입되며, 이는 임플란트와 직접 접촉하지 않을 때 임플란트 분해에 의해 유도되는 국소 환경의 변화에 대한 확립된 세포의 반응을 특성화한다. 직접 배양 및 직접 노출 배양 방법은 동일한 배양 웰에서 임플란트 물질과 직접 또는 간접적으로 접촉하는 세포를 평가한다. 노출 배양물은 동일한 배양 웰에서 규정된 거리 내에서 임플란트 물질과 간접적으로 접촉하는 세포를 특성화한다.
이 기사는 다양한 생분해성 물질에 대한 세포 적합성 테스트 및 모델 세포, 즉 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 프로토콜에는 세포의 수확, 배양, 파종, 고정, 염색 및 이미징과 함께 다양한 생분해성 임플란트 재료 및 광범위한 세포 유형에 적용되는 배양 후 재료 및 배지의 분석이 포함됩니다. 이들 방법은 시험관내에서 세포 반응 및 세포 적합성 측면에서 상이한 생의학적 응용을 위한 생분해성 물질을 스크리닝하는데 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상이한 세포 배양 방법이 생체내 적용의 다양한 양태에 대해 관심있는 생체재료의 시험관내 세포적합성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 기사에서는 세 가지 시험관 내 배양 방법, 즉 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 보여 주어 생분해 성 임플란트 재료가 인체 내부에서 사용되는 다양한 생체 내 시나리오를 모방합니다. 직접 배양 방법은 주로 임플란트 재료?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학 (UC) 리젠트 교수 개발 펠로우십, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 UC-Riverside 논문 연구 보조금 (Jiajia Lin)의 재정 지원에 감사드립니다. 저자들은 SEM/EDS를 사용하기 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Advanced Microscopy and Microanalysis) 중앙 시설(CFAMM)과 XRD 기기 사용을 위한 페리 청 박사를 높이 평가합니다. 저자는 또한 부분 편집을 위해 Thanh Vy Nguyen과 Queenie Xu를 높이 평가합니다. 저자는 또한 비디오에 대한 내레이션을 녹음 한 Cindy Lee에게 감사하고 싶습니다. 이 기사에서 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 국립 과학 재단 또는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 견해를 반드시 반영하지는 않습니다.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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