Vi introduserer tre metoder for direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer. Disse in vitro-metodene etterligner forskjellige in vivo celleimplantatinteraksjoner og kan brukes til å studere ulike biologisk nedbrytbare materialer.
I løpet av de siste tiårene har biologisk nedbrytbare materialer blitt grundig utforsket for biomedisinske applikasjoner som ortopediske, tann- og kraniomaxillofaciale implantater. For å screene biologisk nedbrytbare materialer for biomedisinske applikasjoner, er det nødvendig å evaluere disse materialene når det gjelder in vitro-celleresponser , cytokompatibilitet og cytotoksisitet. International Organization for Standardization (ISO) standarder har blitt mye brukt i evalueringen av biomaterialer. Imidlertid ble de fleste ISO-standarder opprinnelig etablert for å vurdere cytotoksisiteten til ikke-nedbrytbare materialer, og ga dermed begrenset verdi for screening av biologisk nedbrytbare materialer.
Denne artikkelen introduserer og diskuterer tre forskjellige kulturmetoder, nemlig direkte kulturmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer, inkludert biologisk nedbrytbare polymerer, keramikk, metaller og deres kompositter, med forskjellige celletyper. Forskning har vist at kulturmetoder påvirker celleresponsen på biologisk nedbrytbare materialer fordi deres dynamiske nedbrytning induserer romlige forskjeller i grensesnittet og i nærmiljøet. Spesielt avslører den direkte kulturmetoden responsen til celler frø direkte på implantatene; den direkte eksponeringskulturmetoden belyser svarene til etablerte vertsceller som kommer i kontakt med implantatene; og eksponeringskulturmetoden evaluerer de etablerte vertscellene som ikke er i direkte kontakt med implantatene, men påvirkes av endringene i lokalmiljøet på grunn av implantatforringelse.
Denne artikkelen gir eksempler på disse tre kulturmetodene for å studere in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og deres interaksjoner med benmargsavledede mesenchymale stamceller (BMSCer). Den beskriver også hvordan du høster, passerer, kultur, frø, fikser, flekker, karakteriserer cellene og analyserer postkulturmedier og materialer. In vitro-metodene beskrevet i denne artikkelen etterligner forskjellige scenarier av in vivo-miljøet , og utvider anvendbarheten og relevansen av in vitro cytokompatibilitetstesting av forskjellige biomaterialer for ulike biomedisinske applikasjoner.
I flere tiår har biologisk nedbrytbare materialer blitt grundig studert og brukt i biomedisinske applikasjoner som ortopedisk1,2, dental3,4 og craniomaxillofacial5 applikasjoner. I motsetning til permanente implantater og materialer, biologisk nedbrytbare metaller, keramikk, polymerer og deres kompositter gradvis nedbrytes i kroppen over tid via ulike kjemiske reaksjoner i det fysiologiske miljøet. For eksempel er biologisk nedbrytbare metaller som magnesium (Mg) legeringer1,6,7 og sink (Zn) legeringer8,9 lovende materialer for beinfikseringsenheter. Deres biologisk nedbrytbarhet kan eliminere nødvendigheten av sekundære operasjoner for å fjerne implantatene etter beinheling. Biologisk nedbrytbar keramikk som kalsiumfosfatsementer (CPCer) har vist spennende potensial for behandling av osteoporotiske vertebrale kompresjonsbrudd i perkutan kyfoplastikk10. CPC-ene gir mekanisk støtte for den oppsprukne vertebrale kroppen og gradvis nedbrytes etter at bruddet har grodd.
Biologisk nedbrytbare polymerer, som enkelte polysakkarider og polyestere, har også blitt mye utforsket for biomedisinske anvendelser. For eksempel har chitosan hydrogel som biologisk nedbrytbar polysakkarid vist sine evner for å forhindre infeksjon og regenerere hudvev11. Poly-L-melkesyre (PLLA), poly (glykolsyre) (PGA) og poly (melkesyre-med-glykolsyre) (PLGA) er mye studert polyester for fremstilling av 2D eller 3D porøse stillaser for vevsteknikk applikasjoner12,13,14. Videre integrerer komposittmaterialer to eller flere faser av metaller, keramikk og polymerer for å gi avanserte funksjoner for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner15,16,17. For eksempel kan PLGA og kalsiumfosfatkompositter brukes til å fremstille biologisk nedbrytbare stillaser for applikasjoner som reparasjon av skallebenfeil18. Disse biologisk nedbrytbare stillasene og implantatene kan støtte og fremme veksten av celler og vev og deretter gradvis forringes i kroppen over tid.
Som vist i supplerende tabell 1, kan ulike biologisk nedbrytbare materialer ha varierte nedbrytningsmekanismer, produkter og priser. For eksempel magnesiumlegeringer, for eksempel Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% sr (ZSr41)19, og Mg-9 wt% Al-1 wt% sink (AZ91)20, nedbrytning ved å reagere med vann, og deres nedbrytningsprodukter inkluderer hovedsakelig Mg2 + ioner, OH– ioner, H2 gass og mineralavsetninger. Nedbrytningshastigheten for biologisk nedbrytbare metaller varierer avhengig av deres forskjellige sammensetninger, geometrier og nedbrytningsmiljøer. For eksempel rapporterte Cipriano et al.19 at ZSr41-ledninger (Ø1,1 × 15 mm) mistet 85% masse mens rene Mg-ledninger med samme geometri mistet 40% masse etter å ha blitt implantert i rottetibiae i 47 dager. Biologisk nedbrytbare keramiske materialer som hydroksyapatitt (HA) og β-trikalsiumfosfat (β-TCP) kan forringes via løsningsdrevet ekstracellulær væskeoppløsning eller bryte ned i små partikler og deretter forringes via både ekstracellulær væskeoppløsning og cellemedierte resorpsjonsprosesser. Nedbrytningsproduktene til disse kalsiumfosfatbaserte keramikk kan omfatte Ca2+ ioner, (PO4)3-ioner, OH-ioner og mineralavsetninger21. Nedbrytningshastigheten for kalsiumfosfatkeramikk påvirkes betydelig av krystallstrukturene. For eksempel rapporterte Van Blierswijk et al.22 at HA med 40 vol.% mikropores ikke mistet noen masse mens β-TCP med 40 vol.% mikropores mistet 30 ± 4% masse etter å ha blitt implantert i tibiae av kaniner i 3 måneder. Polymerer som PLGA14,23 kan forringes på grunn av hydrolyse av esterkoblingene i nærvær av vann, og nedbrytningsproduktene inkluderer hovedsakelig melkesyre og glykolsyrer. Det kan ta en måned for PLGA 50/50 og flere måneder for PLGA 95/5 å oppnå fullstendig nedbrytning24.
Cellerespons og cytokompatibilitetstesting er avgjørende for å evaluere og screene disse biologisk nedbrytbare implantatmaterialene for biomedisinske anvendelser. Imidlertid ble nåværende standarder fra International Organization for Standardization (ISO), for eksempel ISO 10993-5:2009 “Biologisk evaluering av medisinsk utstyr-Del 5 Tester for in vitro cytotoksisitet”, opprinnelig designet for å vurdere cytotoksisiteten til ikke-nedbrytbare biomaterialer som Ti-legeringer og Cr-Co-legeringer in vitro25. Spesielt dekker ISO 10993-5:2009 bare in vitro cytotoksisitetstester av ekstraktet, direkte kontakt og indirekte kontakttester. I ekstrakttesten fremstilles ekstraktet ved å nedsenke prøver i ekstraksjonsvæsker som kulturmedier med serum og fysiologiske saltvannsløsninger under en av standard tids- og temperaturforholdene. Det innsamlede ekstraktet eller fortynning legges deretter inn i cellekulturen for å studere cytotoksisitet. For den direkte kontakttesten oppnås direkte kontakt mellom prøve og celler ved å plassere testprøven på det etablerte (tilholdte) cellelaget. I den indirekte kontakttesten pipetteres kulturmediene som inneholder serum og smeltet agar for å dekke de etablerte cellene. Prøven plasseres deretter på det størkne agarlaget med eller uten filter.
ISO-standardene har vist noen begrensninger når de brukes til å evaluere biologisk nedbrytbare materialer in vitro. I motsetning til nedbrytbare materialer er nedbrytningsatferden til biologisk nedbrytbare materialer dynamisk og kan endres på et annet tidspunkt eller under varierte miljøforhold (f.eks. temperatur, fuktighet, mediesammensetning og celletype). Ekstrakttesten evaluerer bare cytotoksisiteten til materialets nedbrytningsprodukter og gjenspeiler ikke den dynamiske prosessen med prøveforringelse. Både direkte og indirekte kontakttester av ISO-standarden karakteriserer bare interaksjonene mellom de etablerte cellene og prøvene. Videre, i den indirekte kontakttesten, er materialene og cellene i forskjellige mikromiljøer som ikke reflekterer in vivo-miljøet og ikke fanger den dynamiske nedbrytningen av biologisk nedbrytbare materialer.
Målet med denne artikkelen er å introdusere og diskutere cytokompatibilitetstestingsmetodene for ulike biologisk nedbrytbare implantatmaterialer for å adressere de ovennevnte begrensningene i metodene beskrevet i gjeldende ISO-standarder. Metodene som presenteres i denne artikkelen vurderer den dynamiske nedbrytningsatferden til implantatmaterialer og de forskjellige omstendighetene ved cellematerialeinteraksjoner in vivo. Spesielt gir denne artikkelen tre cytokompatibilitetstestingsmetoder, nemlig direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur for ulike biologisk nedbrytbare materialer, inkludert biologisk nedbrytbare polymerer, keramikk, metaller og deres kompositter for medisinske implantatapplikasjoner.
I den direkte kulturmetoden blir celler suspendert i kulturmediene direkte sådd på prøvene, og evaluerer dermed interaksjonene mellom nylig frøceller og implantatene. I den direkte eksponeringskulturen plasseres prøvene direkte på det etablerte cellelaget for å etterligne samspillet mellom implantater med etablerte vertsceller i kroppen. I eksponeringskulturen plasseres prøvene i sine respektive brønninnlegg og introduseres deretter til kulturbrønnene med etablerte celler, noe som karakteriserer responsen fra etablerte celler til endringene i det lokale miljøet forårsaket av implantatforringelse når de ikke har direkte kontakt med implantater. De direkte kultur- og direkte eksponeringskulturmetodene evaluerer cellene direkte eller indirekte i kontakt med implantatmaterialene i samme kulturbrønn. Eksponeringskulturen karakteriserer cellene indirekte i kontakt med implantatmaterialene innenfor en foreskrevet avstand i samme kulturbrønn.
Denne artikkelen presenterer en detaljert beskrivelse av cytokompatibilitetstesting for forskjellige biologisk nedbrytbare materialer og deres interaksjoner med modellceller, det vil si benmargsavledede mesenchymale stamceller (BMSCer). Protokollene inkluderer høsting, modning, såing, fiksering, farging og avbildning av cellene, sammen med analyser av postkulturmaterialer og medier, som gjelder for en rekke biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og et bredt spekter av celletyper. Disse metodene er nyttige for screening av biologisk nedbrytbare materialer for ulike biomedisinske anvendelser når det gjelder celleresponser og cytokompatibilitet in vitro.
Ulike cellekulturmetoder kan brukes til å evaluere in vitro cytokompatibilitet av biomaterialer av interesse for ulike aspekter av anvendelser in vivo. Denne artikkelen demonstrerer tre in vitrokulturmetoder , det vil si direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur, for å etterligne forskjellige in vivo-scenarier der biologisk nedbrytbare implantatmaterialer brukes inne i menneskekroppen. Den direkte kulturmetoden brukes hovedsakelig til å evaluere oppførselen t…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne setter pris på den økonomiske støtten fra U.S. National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, og Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) og UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Forfatterne setter pris på Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside for bruk av SEM/EDS og Dr. Perry Cheung for bruk av XRD-instrumenter. Forfatterne setter også pris på Thanh Vy Nguyen og Queenie Xu for delvis redigering. Forfatterne vil også takke Cindy Lee for å ha spilt inn fortellingen for videoen. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner, eller anbefalinger uttrykt i denne artikkelen, er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation eller National Institutes of Health.
10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
18 G needle | BD | 305196 | |
25½ G needle | BD | 305122 | |
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
Optical microscope | VWR | VistaVision | |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
pH meter | VWR | model SB70P | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
surgical blade | VWR | 76353-728 | |
Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
Transwell inserts | Corning | 3460 | |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |