Métodos de cultura direta e indireta para estudar materiais de implante biodegradáveis in vitro
Summary
Introduzimos três métodos de cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição para avaliar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradável. Esses métodos in vitro imitam diferentes interações in vivo de implante celular e podem ser aplicados para estudar vários materiais biodegradáveis.
Abstract
Ao longo das últimas décadas, materiais biodegradáveis têm sido amplamente explorados para aplicações biomédicas, como implantes ortopédicos, odontológicos e craniomaxilofaciais. Para testar materiais biodegradáveis para aplicações biomédicas, é necessário avaliar esses materiais em termos de respostas in vitro de células, citocompatibilidade e citotoxicidade. As normas da Organização Internacional para a Padronização (ISO) têm sido amplamente utilizadas na avaliação de biomateriais. No entanto, a maioria das normas ISO foram originalmente estabelecidas para avaliar a citotoxicidade de materiais não degradáveis, fornecendo assim valor limitado para a triagem de materiais biodegradáveis.
Este artigo introduz e discute três diferentes métodos de cultura, a ver, método de cultura direta, método de cultura de exposição direta e método de cultura de exposição para avaliar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradáveis, incluindo polímeros biodegradáveis, cerâmicas, metais e seus compósitos, com diferentes tipos de células. Pesquisas têm mostrado que os métodos culturais influenciam as respostas celulares a materiais biodegradáveis porque sua degradação dinâmica induz diferenças espesso-100 na interface e no ambiente local. Especificamente, o método de cultura direta revela as respostas das células semeadas diretamente nos implantes; o método de cultura de exposição direta elucida as respostas das células hospedeiras estabelecidas que entram em contato com os implantes; e o método de cultura de exposição avalia as células hospedeiras estabelecidas que não estão em contato direto com os implantes, mas são influenciadas pelas mudanças no ambiente local devido à degradação do implante.
Este artigo fornece exemplos desses três métodos culturais para estudar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradável e suas interações com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). Também descreve como colher, passagem, cultura, sementes, fixar, manchar, caracterizar as células e analisar mídias e materiais pós-cultura. Os métodos in vitro descritos neste artigo imitam diferentes cenários do ambiente in vivo , ampliando a aplicabilidade e relevância do teste de citocompatibilidade in vitro de diferentes biomaterias para diversas aplicações biomédicas.
Introduction
Durante décadas, materiais biodegradáveis têm sido extensivamente estudados e utilizados em aplicações biomédicas como aplicações ortopédicas 1,2, odontológico3,4 e craniomaxilofacial5. Ao contrário de implantes e materiais permanentes, metais biodegradáveis, cerâmicas, polímeros e seus compósitos gradualmente se degradam no corpo ao longo do tempo através de diferentes reações químicas no ambiente fisiológico. Por exemplo, metais biodegradáveis como ligas de magnésio (Mg)1,6,7 e ligas de zinco (Zn)8,9 são materiais promissores para dispositivos de fixação óssea. Sua biodegradabilidade poderia eliminar a necessidade de cirurgias secundárias para remover os implantes após a cicatrização óssea. Cerâmicas biodegradáveis, como cimentos fosfato de cálcio (CPCs) têm mostrado potencial empolgante para o tratamento de fraturas de compressão vertebral osteoporótica em kyphoplastia percutânea10. Os CPCs fornecem suporte mecânico para o corpo vertebral fraturado e gradualmente se degradam após a cicatrização da fratura.
Polímeros biodegradáveis, como alguns polissacarídeos e poliésteres, também têm sido amplamente explorados para aplicações biomédicas. Por exemplo, o hidrogel chitosano como um polissacarídeo biodegradável tem exibido suas capacidades para prevenir infecções e regenerar tecidos da pele11. O ácido poli-L-láctico (PLLA), o ácido poli(glicólico) (PGA) e o poli(ácido clicótico-coglicólico) (PLGA) são poliésteres amplamente estudados para a fabricação de andaimes porosos 2D ou 3D para aplicações de engenharia de tecidos12,13,14. Além disso, os materiais compostos integram duas ou mais fases de metais, cerâmicas e polímeros para fornecer funções avançadas para uma ampla gama de aplicações biomédicas15,16,17. Por exemplo, compósitos PLGA e fosfato de cálcio podem ser usados para fabricar andaimes biodegradáveis para aplicações como reparar defeitos ósseos do crânio18. Esses andaimes e implantes biodegradáveis poderiam apoiar e promover o crescimento de células e tecidos e, em seguida, gradualmente degradar-se no corpo ao longo do tempo.
Como mostrado na Tabela Suplementar 1, diferentes materiais biodegradáveis podem ter mecanismos, produtos e taxas variadas de degradação. Por exemplo, ligas de magnésio, como Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, e Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinco (AZ91)20, degradam-se reagindo com água, e seus produtos de degradação incluem principalmente íons Mg2+, íons OH, gás H2 e deposições minerais. A taxa de degradação dos metais biodegradáveis varia dependendo de suas diferentes composições, geometrias e ambientes de degradação. Por exemplo, Cipriano et al.19 relataram que os fios ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perderam 85% de massa, enquanto os fios mg puros com a mesma geometria perderam 40% de massa após serem implantados na tíbia de rato por 47 dias. Materiais cerâmicos biodegradáveis, como hidroxiapatita (HA) e fosfato de tricálgio β (β-TCP) podem se degradar através da dissolução líquida extracelular orientada por soluções ou se dividir em pequenas partículas e, em seguida, degradar-se através de processos de dissolução líquida extracelular e de ressorção mediada por células. Os produtos de degradação dessas cerâmicas à base de fosfato de cálcio podem incluir íons Ca2+, (PO4)3- íons, íons OH e deposições minerais21. A taxa de degradação da cerâmica fosfato de cálcio é significativamente afetada por suas estruturas cristalinas. Por exemplo, Van Blitterswijk et al.22 relataram que a HA com 40 vol.% de microporos não perdeu massa, enquanto β-TCP com 40 vol.% de microporos perdeu 30± 4% de massa após ser implantado na tíbia de coelhos por 3 meses. Polímeros como PLGA14,23 podem se degradar devido à hidrólise das ligações ester na presença de água, e os produtos de degradação incluem principalmente ácidos lácticos e glicólicos. Pode levar um mês para que o PLGA 50/50 e vários meses para o PLGA 95/5 para alcançar a degradação completa24.
Os testes de resposta celular e citocompatibilidade são fundamentais para avaliar e testar esses materiais de implante biodegradável para aplicações biomédicas. No entanto, os padrões atuais da Organização Internacional para a Padronização (ISO), como a ISO 10993-5:2009 “Avaliação biológica de dispositivos médicos-Parte 5 Testes para citoxicidade in vitro“, foram inicialmente projetados para avaliar a citotoxicidade de biomaterias não degradáveis, como as alusões Ti e as teoys Cr-Co de vitro25. Especificamente, a ISO 10993-5:2009 abrange apenas os testes in vitro de citotoxicidade do extrato, contato direto e testes de contato indireto. No teste do extrato, o extrato é preparado por meio de amostras imersas em fluidos de extração, como meios de cultura com soluções de soro e soro fisiológico salino sob uma das condições padrão de tempo e temperatura. O extrato ou diluição coletados é então adicionado à cultura celular para estudar a citotoxicidade. Para o teste de contato direto, o contato direto entre a amostra e as células é obtido colocando a amostra de teste na camada celular estabelecida (aderida). No teste de contato indireto, a mídia cultural contendo soro e ágar derretido é pipeta para cobrir as células estabelecidas. A amostra é então colocada na camada de ágar solidificada com ou sem filtro.
As normas ISO mostraram algumas limitações quando aplicadas para avaliar materiais biodegradáveis in vitro. Ao contrário dos materiais não degradáveis, os comportamentos de degradação de materiais biodegradáveis são dinâmicos e podem mudar em um momento diferente ou em condições ambientais variadas (por exemplo, temperatura, umidade, composição da mídia e tipo celular). O teste extrato avalia apenas a citotoxicidade dos produtos de degradação do material e não reflete o processo dinâmico de degradação amostral. Tanto os testes de contato diretos quanto indiretos do padrão ISO caracterizam apenas as interações entre as células estabelecidas e as amostras. Além disso, no teste de contato indireto, os materiais e células estão em diferentes microambientes que não refletem o ambiente in vivo e não captam a degradação dinâmica de materiais biodegradáveis.
O objetivo deste artigo é introduzir e discutir os métodos de teste de citocompatibilidade para diversos materiais de implante biodegradáveis para abordar as limitações acima mencionadas dos métodos descritos nas normas ISO vigentes. Os métodos apresentados neste artigo consideram o comportamento dinâmico de degradação dos materiais de implante e as diferentes circunstâncias das interações celular-material in vivo. Especificamente, este artigo fornece três métodos de teste de citocompatibilidade, ou seja, cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição para vários materiais biodegradáveis, incluindo polímeros biodegradáveis, cerâmicas, metais e seus compósitos para aplicações de implantemédicos.
No método de cultura direta, as células suspensas nos meios culturais são diretamente semeadas nas amostras, avaliando assim as interações entre células recém-semeadas e os implantes. Na cultura de exposição direta, as amostras são colocadas diretamente na camada celular estabelecida para imitar as interações de implantes com células hospedeiras estabelecidas no corpo. Na cultura de exposição, as amostras são colocadas em suas respectivas pastilhas de poço e, em seguida, introduzidas nos poços de cultura com células estabelecidas, o que caracteriza as respostas das células estabelecidas às mudanças no ambiente local induzidas pela degradação do implante quando não têm contato direto com implantes. Os métodos de cultura direta e cultura de exposição direta avaliam as células direta ou indiretamente em contato com os materiais de implante na mesma cultura bem. A cultura de exposição caracteriza as células indiretamente em contato com os materiais de implante dentro de uma distância prescrita na mesma cultura bem.
Este artigo apresenta uma descrição detalhada dos testes de citocompatibilidade para diferentes materiais biodegradáveis e suas interações com células modelo, ou seja, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). Os protocolos incluem a colheita, cultivo, semeadura, fixação, coloração e imagem das células, juntamente com análises de materiais pós-cultura e mídia, que se aplicam a uma variedade de materiais de implante biodegradável e uma ampla gama de tipos de células. Esses métodos são úteis para a triagem de materiais biodegradáveis para diferentes aplicações biomédicas em termos de respostas celulares e citocompatibilidade in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes métodos de cultura celular podem ser usados para avaliar a citocompatibilidade in vitro de biomateriais de interesse para vários aspectos das aplicações in vivo. Este artigo demonstra três métodos de cultura in vitro , ou seja, cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição, para imitar diferentes cenários in vivo onde materiais de implante biodegradáveis são usados dentro do corpo humano. O método de cultura direta é usado principalmente p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores apreciam o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (NSF CBET 1512764 e NSF PIRE 1545852), dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH NIDCR 1R03DE028631), da Bolsa de Desenvolvimento da Faculdade Regentes da Universidade da Califórnia (UC) Regentes, e do Comitê de Pesquisa seed Grant (Huinan Liu), e da UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiiaaj Lin). Os autores apreciam a Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) na UC-Riverside para o uso de SEM/EDS e Dr. Perry Cheung para o uso de instrumentos XRD. Os autores também apreciam Thanh Vy Nguyen e Queenie Xu por edição parcial. Os autores também gostariam de agradecer Cindy Lee por gravar a narração do vídeo. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência ou dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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