Методы прямого и косвенного культивирования для изучения биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro
Summary
Мы вводим три метода прямого культивирования, культуры прямого воздействия и культуры воздействия для оценки цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro . Эти методы in vitro имитируют различные взаимодействия между клетками и имплантатами in vivo и могут быть применены для изучения различных биоразлагаемых материалов.
Abstract
За последние несколько десятилетий биоразлагаемые материалы были широко исследованы для биомедицинских применений, таких как ортопедические, стоматологические и черепно-мышечно-лицевые имплантаты. Для скрининга биоразлагаемых материалов для биомедицинских применений необходимо оценить эти материалы с точки зрения клеточных реакций in vitro , цитосовместимости и цитотоксичности. Стандарты Международной организации по стандартизации (ИСО) широко используются при оценке биоматериалов. Однако большинство стандартов ИСО были первоначально установлены для оценки цитотоксичности неразлагаемых материалов, что обеспечивает ограниченную ценность для скрининга биоразлагаемых материалов.
В этой статье представлены и обсуждаются три различных метода культивирования, а именно: метод прямого культивирования, метод культуры прямого воздействия и метод культуры воздействия для оценки цитосовместимости in vitro биоразлагаемых материалов имплантатов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты, с различными типами клеток. Исследования показали, что методы культивирования влияют на реакцию клеток на биоразлагаемые материалы, поскольку их динамическая деградация вызывает пространственно-временные различия на границе раздела и в местной среде. В частности, метод прямого культивирования выявляет реакции клеток, посеянных непосредственно на имплантатах; метод культивирования прямого воздействия выявляет реакции установленных клеток-хозяев, вступающих в контакт с имплантатами; и метод культивирования воздействия оценивает установленные клетки-хозяева, которые не находятся в непосредственном контакте с имплантатами, но находятся под влиянием изменений в местной среде из-за деградации имплантата.
В этой статье приведены примеры этих трех методов культивирования для изучения цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro и их взаимодействия с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). В нем также описывается, как собирать, проходить, культивировать, сеять, фиксировать, окрашивать, характеризовать клетки и анализировать посткультурные среды и материалы. Методы in vitro , описанные в этой статье, имитируют различные сценарии среды in vivo , расширяя применимость и актуальность тестирования цитосовместимости различных биоматериалов in vitro для различных биомедицинских применений.
Introduction
На протяжении десятилетий биоразлагаемые материалы широко изучались и использовались в биомедицинских приложениях, таких как ортопедические1,2, стоматологические3,4 и черепно-челюстно-лицевые5. В отличие от постоянных имплантатов и материалов, биоразлагаемые металлы, керамика, полимеры и их композиты постепенно разлагаются в организме с течением времени в результате различных химических реакций в физиологической среде. Например, биоразлагаемые металлы, такие как магниевые (Mg) сплавы1,6,7 и цинковые (Zn) сплавы8,9, являются перспективными материалами для устройств фиксации кости. Их биоразлагаемость может устранить необходимость вторичных операций по удалению имплантатов после заживления кости. Биоразлагаемая керамика, такая как цементы фосфата кальция (CPC), показала захватывающий потенциал для лечения остеопоротических компрессионных переломов позвонков при чрескожной кифопластике10. ЦПК обеспечивают механическую поддержку сломанного тела позвонка и постепенно деградируют после заживления перелома.
Биоразлагаемые полимеры, такие как некоторые полисахариды и полиэфиры, также широко исследовались для биомедицинских применений. Например, гидрогель хитозана как биоразлагаемый полисахарид продемонстрировал свои способности предотвращать инфекцию и регенерировать ткани кожи11. Поли-L-молочная кислота (PLLA), поли(гликолевая кислота) (PGA) и поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA) являются широко изученными полиэфирами для изготовления 2D или 3D пористых каркасов для тканевой инженерии12,13,14. Кроме того, композиционные материалы объединяют две или более фаз металлов, керамики и полимеров, чтобы обеспечить расширенные функции для широкого спектра биомедицинских применений15,16,17. Например, композиты PLGA и фосфата кальция могут быть использованы для изготовления биоразлагаемых каркасов для таких применений, как восстановление дефектов костей черепа18. Эти биоразлагаемые каркасы и имплантаты могут поддерживать и стимулировать рост клеток и тканей, а затем постепенно разлагаться в организме с течением времени.
Как показано в Дополнительной таблице 1, различные биоразлагаемые материалы могут иметь различные механизмы деградации, продукты и скорости. Например, магниевые сплавы, такие как Mg-2 мас.% Zn-0,5 мас.% Ca (ZC21)1, Mg-4 мас.% Zn-1 мас.% Sr (ZSr41)19 и Mg-9 мас.% Al-1 мас.% цинка (AZ91)20, разлагаются в результате взаимодействия с водой, и их продукты деградации в основном включают ионы Mg2+, OH-ионы, газ H2 и минеральные осаждения. Скорость деградации биоразлагаемых металлов варьируется в зависимости от их различного состава, геометрии и среды деградации. Например, Cipriano et al.19 сообщили, что провода ZSr41 (Ø1,1 × 15 мм) потеряли 85% массы, в то время как чистые провода Mg с той же геометрией потеряли 40% массы после имплантации в большеберцовую кость крысы в течение 47 дней. Биоразлагаемые керамические материалы, такие как гидроксиапатит (ГК) и β-трикальцийфосфат (β-TCP), могут разлагаться через внеклеточное растворение жидкости или распадаться на мелкие частицы, а затем разлагаться как через внеклеточное жидкое растворение, так и через процессы резорбции, опосредованные клетками. Продукты разложения этих керамических изделий на основе фосфата кальция могут включать ионы Ca2+, (PO4)3-ионы, OH-ионы и минеральные осаждения21. Скорость деградации керамики фосфата кальция значительно зависит от ее кристаллической структуры. Например, Van Blitterswijk et al.22 сообщили, что ГК с 40 об.% микропор не теряла массы, в то время как β-TCP с 40 об.% микропор потерял 30 ± 4% массы после имплантации в большеберцовые кости кроликов в течение 3 месяцев. Полимеры, такие как PLGA14,23, могут разлагаться из-за гидролиза эфирных связей в присутствии воды, а продукты разложения в основном включают молочную и гликолевую кислоты. Для достижения полной деградации PLGA 50/50 может потребоваться один месяц, а для PLGA 95/5 – несколько месяцев24.
Клеточный ответ и тестирование цитосовместимости имеют решающее значение для оценки и скрининга этих биоразлагаемых материалов имплантатов для биомедицинских применений. Однако текущие стандарты Международной организации по стандартизации (ISO), такие как ISO 10993-5:2009 «Биологическая оценка медицинских устройств – Часть 5 Тесты на цитотоксичность in vitro», изначально были разработаны для оценки цитотоксичности неразлагаемых биоматериалов, таких как ti-сплавы и сплавы Cr-Co in vitro25. В частности, ISO 10993-5:2009 охватывает только тесты на цитотоксичность экстракта in vitro, тесты на прямой контакт и косвенный контакт. В тесте экстракта экстракт получают путем погружения образцов в экстракционные жидкости, такие как питательные среды с сывороткой и физиологические солевые растворы в одном из стандартных временных и температурных условий. Собранный экстракт или разбавление затем добавляют в культуру клеток для изучения цитотоксичности. Для испытания на прямой контакт прямой контакт между образцом и клетками достигается путем помещения испытуемого образца на установленный (приклеенный) клеточный слой. В тесте на косвенный контакт культуральная среда, содержащая сыворотку и расплавленный агар, пипетируется для покрытия установленных клеток. Затем образец помещают на затвердевший слой агара с фильтром или без него.
Стандарты ИСО показали некоторые ограничения при применении для оценки биоразлагаемых материалов in vitro. В отличие от неразлагаемых материалов, поведение деградации биоразлагаемых материалов является динамическим и может изменяться в разное время или в различных условиях окружающей среды (например, температура, влажность, состав среды и тип ячейки). Тест экстракта оценивает только цитотоксичность продуктов разложения материала и не отражает динамический процесс деградации образца. Как прямые, так и косвенные контактные тесты стандарта ISO характеризуют только взаимодействия между установленными ячейками и образцами. Кроме того, при испытании на косвенный контакт материалы и клетки находятся в различных микросредах, которые не отражают среду in vivo и не улавливают динамическую деградацию биоразлагаемых материалов.
Целью данной статьи является представление и обсуждение методов тестирования цитосовместимости для различных биоразлагаемых материалов имплантатов для устранения вышеупомянутых ограничений методов, описанных в текущих стандартах ISO. Методы, представленные в данной статье, учитывают динамическое деградационное поведение материалов имплантатов и различные обстоятельства взаимодействия клеток и материалов in vivo. В частности, в этой статье представлены три метода тестирования цитосовместимости, а именно прямая культура, культура прямого воздействия и культура воздействия для различных биоразлагаемых материалов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты для применения в медицинских имплантатах.
В методе прямого культивирования клетки, взвешенные в культуральной среде, непосредственно засеивают на образцы, тем самым оценивая взаимодействие между вновь засеянными клетками и имплантатами. В культуре прямого воздействия образцы помещаются непосредственно на установленный клеточный слой, чтобы имитировать взаимодействие имплантатов с установленными клетками-хозяевами в организме. В культуре воздействия образцы помещают в соответствующие вкладыши колодца, а затем вводят в культуральные колодцы с установленными клетками, что характеризует реакцию установленных клеток на изменения в местной среде, вызванные деградацией имплантата, когда они не имеют прямого контакта с имплантатами. Методы культуры прямого и прямого воздействия оценивают клетки, прямо или косвенно контактирующие с материалами имплантата в той же культуре. Экспозиционная культура характеризует клетки, косвенно контактирующие с материалами имплантата в пределах предписанного расстояния в той же культуре.
В данной статье представлено подробное описание тестирования цитосовместимости различных биоразлагаемых материалов и их взаимодействия с модельными клетками, то есть мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). Протоколы включают сбор, культивирование, посев, фиксацию, окрашивание и визуализацию клеток, а также анализы посткультурных материалов и сред, которые применяются к различным биоразлагаемым материалам имплантатов и широкому спектру типов клеток. Эти методы полезны для скрининга биоразлагаемых материалов для различных биомедицинских применений с точки зрения клеточных реакций и цитосовместимости in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные методы культивирования клеток могут быть использованы для оценки цитосовместимости биоматериалов in vitro , представляющих интерес для различных аспектов применения in vivo. В этой статье демонстрируются три метода культивирования in vitro , то есть прямая культура, ку?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы высоко оценивают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (NSF CBET award 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии регентов Калифорнийского университета (UC) и Комитета по исследовательскому гранту семян (Huinan Liu) и гранта UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Авторы высоко оценивают Центральный центр передовой микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде за использование SEM / EDS и доктора Перри Чунга за использование инструментов XRD. Авторы также ценят Thanh Vy Nguyen и Queenie Xu за частичное редактирование. Авторы также хотели бы поблагодарить Синди Ли за запись повествования для видео. Любые мнения, выводы и выводы, выраженные в этой статье, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
References
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
- Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
- Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
- Wu, C. -. C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
- Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
- Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
- Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
- Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
- Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
- Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
- Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
- Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
- Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
- Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
- Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
- Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
- Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
- Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
- Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
- Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
- Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
- Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
- Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
- Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
- Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
- Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
- Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
- Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
- Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
- Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
- Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
- Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
- Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
- Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
- Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
- Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
- Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
- Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
- Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
- Wetteland, C. L., Nguyen, N. -. Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
- Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
- Wang, H. . Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , (2004).
