Direkta och indirekta odlingsmetoder för att studera biologiskt nedbrytbara implantatmaterial in vitro
Summary
Vi introducerar tre metoder för direkt kultur, direkt exponeringskultur och exponeringskultur för att utvärdera in vitro-cytokompatibiliteten hos biologiskt nedbrytbara implantatmaterial. Dessa in vitro-metoder efterliknar olika interaktioner mellan in vivo-cellimplantat och kan tillämpas för att studera olika biologiskt nedbrytbara material.
Abstract
Under de senaste decennierna har biologiskt nedbrytbara material undersökts i stor utsträckning för biomedicinska tillämpningar som ortopediska, dental och kraniomaxillofacial implantat. För att screena biologiskt nedbrytbara material för biomedicinska tillämpningar är det nödvändigt att utvärdera dessa material i termer av in vitro-cellssvar , cytokompatibilitet och cytotoxicitet. Iso-standarder (International Organization for Standardization) har använts i stor utsträckning vid utvärdering av biomaterial. De flesta ISO-standarder fastställdes dock ursprungligen för att bedöma cytotoxiciteten hos icke-nedbrytbara material, vilket ger begränsat värde för screening av biologiskt nedbrytbara material.
Denna artikel introducerar och diskuterar tre olika odlingsmetoder, nämligen direkt odlingsmetod, direkt exponering kulturmetod och exponering kulturmetod för utvärdering in vitro cytocompatibility av biologiskt nedbrytbara implantat material, inklusive biologiskt nedbrytbara polymerer, keramik, metaller, och deras kompositer, med olika celltyper. Forskning har visat att odlingsmetoder påverkar cellreaktioner på biologiskt nedbrytbara material eftersom deras dynamiska nedbrytning inducerar spatiotemporala skillnader i gränssnittet och i den lokala miljön. Specifikt avslöjar den direkta odlingsmetoden svaren från celler som sås direkt på implantaten; Metoden för direkt exponeringskultur belyser svaren från etablerade värdceller som kommer i kontakt med implantaten. och exponeringskulturmetoden utvärderar de etablerade värdcellerna som inte är i direkt kontakt med implantaten men påverkas av förändringarna i den lokala miljön på grund av implantatnedbrytning.
Denna artikel ger exempel på dessa tre kultur metoder för att studera in vitro cytocompatibility av biologiskt nedbrytbara implantat material och deras interaktioner med benmärg-härledda mesenchymal stamceller (BMSCs). Det beskriver också hur man skördar, passage, kultur, frö, fix, fläck, karakteriserar cellerna och analyserar postkulturmedier och material. De in vitro-metoder som beskrivs i denna artikel efterliknar olika scenarier i in vivo-miljön , breddar tillämpligheten och relevansen av in vitro cytocompatibility testning av olika biomaterial för olika biomedicinska tillämpningar.
Introduction
I årtionden har biologiskt nedbrytbara material studerats och använts i biomedicinska tillämpningar som ortopediska 1,2, dental3,4 och kraniomaxillofacial5 applikationer. Till skillnad från permanenta implantat och material bryts biologiskt nedbrytbara metaller, keramik, polymerer och deras kompositer gradvis ned i kroppen över tid via olika kemiska reaktioner i den fysiologiska miljön. Till exempel är biologiskt nedbrytbara metaller som magnesiumlegeringar (Mg) 1,6,7 och zinklegeringar (Zn) 8,9 lovande material för benfixeringsenheter. Deras biologiska nedbrytbarhet kan eliminera behovet av sekundära operationer för att ta bort implantaten efter benläkning. Biologiskt nedbrytbar keramik såsom kalciumfosfatcement (CPCs) har visat spännande potential för behandling av osteoporotiska kotkompressionsfrakturer i perkutan kyphoplasty10. CPCs ger mekaniskt stöd för den brutna kotkroppen och bryts gradvis ner efter att frakturen har läkt.
Biologiskt nedbrytbara polymerer, såsom vissa polysackarider och polyesterer, har också undersökts i stor utsträckning för biomedicinska tillämpningar. Till exempel har chitosan hydrogel som biologiskt nedbrytbar polysackarrid uppvisat sin förmåga att förebygga infektion och regenerera hudvävnad11. Poly-L-mjölksyra (PLLA), poly(glykolsyra) (PGA) och poly (mjölkkolykolsyra) (PLGA) är allmänt studerade polyesterer för tillverkning av 2D- eller 3D-porösa ställningar för vävnadstekniska tillämpningar12,13,14. Dessutom integrerar kompositmaterial två eller flera faser av metaller, keramik och polymerer för att ge avancerade funktioner för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar15,16,17. Plga- och kalciumfosfatkompositer kan till exempel användas för att tillverka biologiskt nedbrytbara byggnadsställningar för tillämpningar som reparation av skallbensdefekter18. Dessa biologiskt nedbrytbara byggnadsställningar och implantat kan stödja och främja tillväxten av celler och vävnader och sedan gradvis försämras i kroppen med tiden.
Som visas i kompletterande tabell 1 kan olika biologiskt nedbrytbara material ha olika nedbrytningsmekanismer, produkter och hastigheter. Till exempel, magnesiumlegeringar, såsom Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, och Mg-9 wt% Al-1 wt% Zink (AZ91)20, försämras genom att reagera med vatten, och deras nedbrytningsprodukter inkluderar främst Mg2 + joner, OH– joner. Nedbrytningshastigheten för biologiskt nedbrytbara metaller varierar beroende på deras olika sammansättningar, geometrier och nedbrytningsmiljöer. Till exempel rapporterade Cipriano et al.19 att ZSr41-ledningar (Ø1,1 × 15 mm) förlorade 85% massa medan rena Mg-ledningar med samma geometri förlorade 40% massa efter att ha implanterats i rått skenbenet i 47 dagar. Biologiskt nedbrytbara keramiska material som hydroxyapatit (HA) och β-trikalciumfosfat (β-TCP) kan brytas ned via lösningsdriven extracellulär vätskeupplösning eller brytas ned till små partiklar och sedan brytas ned via både extracellulär vätskeupplösning och cellmedierad resorptionsprocesser. Nedbrytningsprodukterna i dessa kalciumfosfatbaserade keramik kan innehålla Ca2+ joner, (PO4)3- joner, OH– joner och mineraldeponationer21. Nedbrytningshastigheten för kalciumfosfatkeramik påverkas avsevärt av deras kristallstrukturer. Till exempel rapporterade Van Blitterswijk et al.22 att HA med 40 vol.% mikroporer inte förlorade någon massa medan β-TCP med 40 vol.% mikroporer förlorade 30 ± 4% massa efter att ha implanterats i skenbenet av kaniner i 3 månader. Polymerer som PLGA14,23 kan brytas ned på grund av hydrolys av esterlänkage i närvaro av vatten, och nedbrytningsprodukterna omfattar främst mjölksyra och glykolsyror. Det kan ta en månad för PLGA 50/50 och flera månader för PLGA 95/5 att uppnå fullständig nedbrytning24.
Cellrespons och cytokompatibilitetstestning är avgörande för att utvärdera och screena dessa biologiskt nedbrytbara implantatmaterial för biomedicinska tillämpningar. Nuvarande standarder från Internationella standardiseringsorganisationen (ISO), såsom ISO 10993-5:2009 “Biologisk utvärdering av medicintekniska produkter-Del 5 Tester för in vitro cytotoxicitet”, utformades dock ursprungligen för att bedöma cytotoxiciteten hos icke-nedbrytbara biomaterial som Ti legeringar och Cr-Co-legeringar in vitro25. Specifikt omfattar ISO 10993-5:2009 endast in vitro cytotoxicitetstester av extraktet, direktkontakt och indirekt kontakttest. I extrakttestet framställs extraktet genom att nedsänka prover i extraktionsvätskor som odlingsmedier med serum och fysiologiska saltlösningar under ett av standardtids- och temperaturförhållandena. Det insamlade extraktet eller utspädningen tillsätts sedan i cellkulturen för att studera cytotoxicitet. För direktkontakttestet uppnås direktkontakt mellan prov och celler genom att provexemplaret placeras på det etablerade (vidhäftade) cellskiktet. I det indirekta kontakttestet är odlingsmediet som innehåller serum och smält agar pipetted för att täcka de etablerade cellerna. Provet placeras sedan på det stelnade agarskiktet med eller utan filter.
ISO-standarderna har visat vissa begränsningar när de tillämpas för att utvärdera biologiskt nedbrytbara material in vitro. Till skillnad från icke nedbrytbara material är nedbrytningsbeteendena hos biologiskt nedbrytbara material dynamiska och kan förändras vid en annan tidpunkt eller under olika miljöförhållanden (t.ex. temperatur, fuktighet, mediekomposition och celltyp). Extrakttestet utvärderar endast cytotoxiciteten hos materialets nedbrytningsprodukter och återspeglar inte den dynamiska processen för provnedbrytning. Både direkta och indirekta kontakttester av ISO-standarden kännetecknar endast interaktionerna mellan de etablerade cellerna och proverna. I det indirekta kontakttestet befinner sig dessutom materialen och cellerna i olika mikromiljö som inte återspeglar in vivo-miljön och inte fångar upp den dynamiska nedbrytningen av biologiskt nedbrytbara material.
Syftet med denna artikel är att införa och diskutera cytokompatibilitetstestmetoderna för olika biologiskt nedbrytbara implantatmaterial för att ta itu med de ovannämnda begränsningarna för de metoder som beskrivs i de nuvarande ISO-standarderna. De metoder som presenteras i denna artikel överväga den dynamiska nedbrytningsbeteendet hos implantatmaterial och de olika omständigheterna för cell-material interaktioner in vivo. Specifikt ger den här artikeln tre cytokompatibilitetstestmetoder, nämligen direktkultur, direkt exponeringskultur och exponeringskultur för olika biologiskt nedbrytbara material, inklusive biologiskt nedbrytbara polymerer, keramik, metaller och deras kompositer för medicinska implantatapplikationer.
I den direkta odlingsmetoden sås celler som suspenderas i odlingsmedierna direkt på proverna, vilket utvärderar interaktionerna mellan nysådda celler och implantaten. I den direkta exponeringskulturen placeras proverna direkt på det etablerade cellskiktet för att efterlikna interaktionerna mellan implantat och etablerade värdceller i kroppen. I exponeringskulturen placeras proverna i sina respektive brunnsinsatser och introduceras sedan till odlingsbrunnarna med etablerade celler, vilket kännetecknar svaren från etablerade celler på de förändringar i den lokala miljön som induceras av implantatnedbrytning när de inte har någon direkt kontakt med implantat. De direkta odlings- och direktexponeringskulturmetoderna utvärderar cellerna direkt eller indirekt i kontakt med implantatmaterialen i samma kulturbrunn. Exponeringskulturen kännetecknar cellerna indirekt i kontakt med implantatmaterialen inom ett föreskrivet avstånd i samma kulturbrunn.
Denna artikel presenterar en detaljerad beskrivning av cytokompatibilitet testning för olika biologiskt nedbrytbara material och deras interaktioner med modellceller, det vill säga benmärg-härledda mesenchymala stamceller (BMSCs). Protokollen inkluderar skörd, odling, sådd, fixering, färgning och avbildning av cellerna, tillsammans med analyser av postkulturmaterial och media, som gäller för en mängd biologiskt nedbrytbara implantatmaterial och ett brett spektrum av celltyper. Dessa metoder är användbara för screening av biologiskt nedbrytbara material för olika biomedicinska tillämpningar när det gäller cellsvar och cytokompatibilitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olika cellodlingsmetoder kan användas för att utvärdera in vitro cytokompatibilitet av biomaterial av intresse för olika aspekter av applikationer in vivo. Denna artikel visar tre in vitro-odlingsmetoder , dvs direktkultur, direkt exponeringskultur och exponeringskultur, för att efterlikna olika in vivo-scenarier där biologiskt nedbrytbara implantatmaterial används inuti människokroppen. Den direkta odlingsmetoden används främst för att utvärdera beteendet hos nysådda cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppskattar det ekonomiska stödet från U.S. National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 and NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship och Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) och UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Författarna uppskattar centralfaciliteten för avancerad mikroskopi och mikroanalys (CFAMM) vid UC-Riverside för användning av SEM/ EDS och Dr. Perry Cheung för användning av XRD-instrument. Författarna uppskattar också Thanh Vy Nguyen och Queenie Xu för partiell redigering. Författarna vill också tacka Cindy Lee för att ha spelat in berättelsen för videon. Alla åsikter, resultat och slutsatser, eller rekommendationer som uttrycks i den här artikeln är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna från National Science Foundation eller National Institutes of Health.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
References
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
- Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
- Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
- Wu, C. -. C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
- Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
- Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
- Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
- Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
- Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
- Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
- Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
- Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
- Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
- Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
- Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
- Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
- Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
- Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
- Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
- Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
- Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
- Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
- Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
- Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
- Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
- Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
- Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
- Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
- Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
- Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
- Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
- Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
- Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
- Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
- Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
- Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
- Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
- Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
- Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
- Wetteland, C. L., Nguyen, N. -. Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
- Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
- Wang, H. . Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , (2004).
