Denne protokol skitserer båndmetoden til, hvordan man manuelt konstruerer et vævsmikroarray ved hjælp af FFPE-donorblokke med forskellige dybder.
Vævsmikroarray (TMA) er et vigtigt forskningsværktøj, hvor mange formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) prøver kan repræsenteres i en enkelt paraffinblok. Dette opnås ved at anvende vævskerner ekstraheret fra interesseområdet for forskellige donor FFPE-blokke og arrangere dem i en enkelt TMA-paraffinblok. Når de er konstrueret, kan sektioner fra den færdige TMA bruges til at udføre immunohistokemi, kromogen, fluorescens in situ-hybridisering (FISH) og RNA ISH-undersøgelser til vurdering af proteinekspression samt genomiske og transkriptionelle ændringer i mange prøver samtidigt, hvilket minimerer vævsbrug og reducerer reagensomkostningerne. Der findes flere forskellige TMA konstruktionsteknikker. En af de mest almindelige konstruktionsmetoder er modtagermetoden, som fungerer bedst med kerner af samme længde, for hvilke der anbefales en minimumslængde på 4 mm. Desværre kan vævsblokke stærkt resekteres under diagnoseprocessen, hvilket ofte resulterer i “ikke-ideelle” donorbloktykkelser på mindre end 4 mm. Den aktuelle artikel og video fokuserer på den dobbeltsidede klæbebåndsmetode; en alternativ manuel, billig, nem at bruge og hurtig metode til at konstruere TMA’er med lav densitet (<50 kerner), der er yderst kompatible med disse ikke-ideelle donorblokke. Denne protokol giver en trinvis vejledning i, hvordan man konstruerer en TMA ved hjælp af denne metode med fokus på den kritiske betydning af patologisk gennemgang og validering efter konstruktion.
Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv anvendes i vid udstrækning i morfologiske og immunohistokemiske proteinekspressionsundersøgelser1. Opdagelsesforskning kræver dog ofte undersøgelse af flere markører på et stort antal væv, som kan udtømme dyrebare væv. Vævsmikroarray (TMA), der blev introduceret i 1980’erne, er et vigtigt forskningsværktøj, der samler små eksemplariske regioner af interesse fra mange forskellige FFPE-vævsblokke i en enkelt paraffinblok, hvilket muliggør undersøgelse af mange vævsprøver samtidigt2. TMA’er undgår således overdreven brug af meget dyrebare og ofte sjældne vævsprøver, samtidig med at omkostningerne forbundet med at udføre downstream-applikationer på mange individuelle prøverreduceres 3,4.
Der findes flere forskellige teknikker til konstruktion afTMA’er 5, herunder automatiserede og halvhåndbogs manuelle tilgange 6,7. Størstedelen af disse sidstnævnte tilgange anvender modtagermetoden, hvor vævskerner stanset fra donorblokke indsættes i en præfabrikeret form. Det anbefales dog, at der anvendes “ideelle” donorblokke, der er mindst 4 mm tykke, til denne metode 6,7. Desværre er donorblokke, især dem, der er blevet grundigt sektioneret til kliniske diagnostiske formål, inden de stilles til rådighed for forskning, ofte mindre end 4 mm tykke, hvilket kan udelukke dem fra anvendelse i TMA-konstruktion ved hjælp af modtagermetoden, hvis det ikke er muligt eller ønskeligt at genindlejrere for at opnå en dybde på 4 mm. Desuden kan disse procedurer ofte bruge en stationær manuel vævsmikroarrayer eller dyre automatiserede instrumenter, der ikke er let tilgængelige eller overkommelige for det gennemsnitlige forskningslaboratorium. I modsætning hertil er den dobbeltsidede klæbebåndsmetode eller båndmetode en manuel TMA-konstruktionsmetode, der er kompatibel med ikke-ideelle donorblokke, der bruger billige, bredt tilgængelige, genanvendelige eller engangs håndholdte vævsmikroarrayers 8,9,10. Denne metode vender byggeprocessen om ved at støbe blokken rundt omvendte opretstående kerner, der efter færdiggørelsen flugter med toppen af TMA, uanset kernelængden. Som et resultat er alle prøver til stede i TMA-sektioner, når de først sektioneres, hvilket gør det muligt for konstruktøren at få mest muligt ud af disse ikke-ideelle blokke fra starten. Båndmetoden repræsenterer således et omkostningseffektivt og gennemførligt alternativ for de ikke-specialiserede forskningslaboratorier.
TMA-konstruktionen er ikke uden udfordringer, og der skal udvises forsigtighed ved udvælgelsen af de vævsområder, der skal udtrækkes kernerne fra, hvilket gør patologisk gennemgang til en kritisk del af TMA-byggeprocessen11,12. Denne protokol har således til formål at understrege den dybe betydning af patologisk gennemgang i TMA-konstruktion ved at fremhæve nogle af de patologiske faldgruber forbundet med TMA-konstruktion, som personer, der konstruerer og bruger TMA’er, bør være opmærksomme på, og hvorfor patologisk gennemgang bør fortsætte gennem levetiden for en TMA-blok.
Denne protokol skitserer de skridt, der er taget på AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory for at konstruere TMA’er fra ikke-ideelle donorblokke ved hjælp af båndmetoden; hvor ACSR er et NIH-finansieret biorepositori dedikeret til indsamling og retfærdig fordeling af bioprøveemner fra hiv-kræftvæv med henblik på at fremme hiv-malignitetsforskning.
En af de mest kritiske komponenter i TMA-byggeprocessen er patologisk gennemgang af FFPE-donorblokke, hvorfra TMA-kernerne vil blive opnået4. Under gennemgangen undersøger en bestyrelsescertificeret patolog en repræsentativ H & E-farvet vævssektion fra hver donorblok. Det er bydende nødvendigt, at H&E genereres ved hjælp af en friskskåret vævssektion, så den er den bedste repræsentation af den tilsvarende donorblok. Anvendelse af ældre H&Es anbefales ikke, da FFPE-væv er 3-dimensionelle strukturer, hvis vævsprofil kan ændre sig betydeligt med blokdybde og omfattende sektionering; dette kan være sket, siden H&E blev genereret, hvilket potentielt gør dets repræsentation af FFPE-blokken unøjagtig. Revisionsprocessen er afgørende for udvælgelsen af egnede tilfælde og identifikationen af vævsområder, hvorfra kerner bør udgå, samt identifikation af områder, der bør undgås ved indsamling af kerner. I mangel af patologisk gennemgang øges sandsynligheden for at inkludere uegnede væv betydeligt. Optagelse af sådanne væv har potentiale til at gøre den konstruerede TMA ineffektiv og uegnet til det tilsigtede formål. Det er vigtigt, at ubevidst brug af sådanne ineffektive TMA’er har et enormt potentiale til at resultere i falske og vildledende data. Dette kombineret med viden om, at profilen af FFPE-væv og dermed deres afledte kerner kan ændre sig markant med stigende dybde, understreger vigtigheden af fortsat patologisk gennemgang gennem hele levetiden for en konstrueret TMA-blok. Ideelt set bør H&Es genereres ved hjælp af hver 15. eller 20. sektion for at sikre, at eventuelle ændringer i kernernes vævsprofiler fanges og registreres. Som minimum bør H&Es genereres og revideres ved starten og slutningen af et projekt for at overvåge disse potentielle ændringer. I lyset af disse punkter og TMA’s betydning som et forskningsværktøj er det bydende nødvendigt, at den patologiske gennemgang er fast forankret i TMA-byggeprocessen og i hele TMA-blokkens levetid.
FFPE-blokke sektionerer ofte i vid udstrækning under rutinemæssig diagnostisk behandling, inden de frigives til forskningsformål. Som følge heraf er donorblokdybden og dermed donorblokkens kernelængder ofte mindre end modtagermetodens ideal på 4 mm. Her har vi demonstreret, hvordan man konstruerer TMA’er ved hjælp af båndmetodekonstruktionsprotokollen, hvis største fordel er dens kompatibilitet med kerner fra ikke-ideelle FFPE-vævsblokke. Selvom båndmetoden er af stor forskningsværdi og tilbyder en billig, bekvem og tilgængelig metode til konstruktion af TMA-blokke, er den ikke uden udfordringer og begrænsninger. Sammenlignet med både automatiserede og manuelle modtagermetoder, som kan rumme 100-1.000-vis af kerner i en enkelt TMA-blok, anbefales maksimalt 40 kerner til TMA’er konstrueret ved hjælp af båndmetoden9. En anden begrænsning er med hensyn til den lette konstruktion. I modtagermetoden indsættes stansede kerner blot i en præfabrikeret form, som giver kernestabilitet ved at indkapsle hver kerne i sin egen individuelle brønd og derved forhindre kernemigration samt fremme meget regelmæssig kerneplacering og adskillelse22. Desuden tilbyder modtagermetoden den valgfri bekvemmelighed at være fuldt manuel, halvmanual og fuldt automatiseret. I modsætning hertil kræver den manuelle båndmetode omhyggelig, skånsom placering af hver kerne i hånden ved hjælp af en nåleplukker. Selvom fraværet af en præfabrikeret form i båndmetoden udelukker den meget regelmæssige placering og adskillelse, der opleves med modtagermetoden, overvindes denne mangel ved at inkludere et ternet gitter. Det er vigtigt, at det ternede gitter er fastgjort til midten af metalbakken for at undgå placering af blokkanter, hvilket øger risikoen for kernetab, hvis der ikke er tilstrækkelig paraffin, der holder kernen på plads. Det skal også bemærkes, at de små kerneadskillelser, der er mulige med modtagermetoden, ikke kan opnås med båndmetoden på grund af manuel kerneplacering og behovet for, at nålepluk passer mellem tilstødende kerner. Kerner placeres på en fritstående oprejst måde med det mindste overfladeareal eller fodaftryk af kernen, der kommer i kontakt med det DSST-dækkede gitter. Denne opsætning giver betydeligt mindre kernestabilitet end modtagermetoden og giver en øget risiko for kernepåståning og eller migration, når den smeltede paraffin hældes. Faktisk er et af de mest kritiske trin i protokollen at hælde den smeltede paraffin. Det er vigtigt, at dette gøres hurtigt ved fjernelse fra ovnen for at sikre, at paraffinen er helt flydende, og at hældningen udføres forsigtigt med minimal turbulens. Interessant nok udviklede Chen et al. en meget ny hjælpeanordning, beslægtet med en stencil med huller med en diameter på 7 x 11 jævnt fordelt 2 mm diameter, der placeres oven på en tom paraffinblok for at styre nåle, når modtagerblokken oprettes, og når donorblokkernerne indsættes23. Selvom den er designet til at hjælpe modtagerblokkonstruktionen, kunne en sådan enhed let tilpasses båndmetoden til at styre placeringen, regulere adskillelsen og øge kernestabiliteten under byggeprocessen.
En af de mest betydningsfulde effektorer af kernestabilitet er antallet af kerner, der indgår i en båndmetode TMA. Dette skyldes, at når antallet af kerner stiger, skal kernens diameter reduceres for at imødekomme det stigende antal kerner, hvilket igen reducerer kernefodaftrykket, der overholder DSST. En mindste kernediameter på 1 mm anbefales til båndmetode TMA-konstruktion, da vi har fundet ud af, at kerner med mindre diametre er særligt ustabile og tilbøjelige til at vælte selv med meget blid paraffinhældning. En nylig undersøgelse, der undersøgte to forskellige interne metoder, der brugte 16 G nåle (kernediameter på 1,1 mm) og en 4 mm diameter stans, oplevede betydelige vævstab med 1,1 mm (26,5%), men ikke 4 mm kernerne24. Dette tyder på, at små kerner kan være problematiske at arbejde med og ikke kun under konstruktionen. Desuden repræsenterer mindre diametre muligvis ikke den oprindelige donorblok såvel som større kerner, hvilket gør patologisk fortolkning vanskelig og øger sandsynligheden for unøjagtig repræsentation af donorvæv.
Inddragelse og placering af orienteringsblokke er af stor betydning i TMA-konstruktion. Dette er dog af særlig betydning for båndmetodekonstruerede TMA’er. Det skyldes, at båndmetoden vender byggeprocessen om og dermed øger risikoen for rumlig desorientering. Vi anbefaler, at du inkluderer op til tre orienteringskerner i hver blok, og at de placeres væk fra prøvekernerne for bedst muligt at orientere blokken. Orienteringskerner kan være kerner taget fra vævsblokke, der indeholder tydeligt forskellige væv fra temaet for de konstruerede TMA- eller vævsfrie orienteringsværktøjer21, hvor sidstnævnte er særlig nyttig for ikke-patologer. Kombineret med ikke-regelmæssig matrixmønstret kerneplacering minimerer orienteringskerner risikoen for desorientering.
Den markante forskel i kernelængde mellem TMA’er konstrueret ved hjælp af tape- og modtagermetoderne stammer fra inddragelse af donorblokdybde i beslutningsprocessen, når byggemetoden vælges. Den protokol, der er skitseret her, anvender en tærskel, hvor TMA’er konstrueres ved hjælp af tape- og modtagermetoderne, når donorblokkene har dybder på henholdsvis <4 mm og 4 mm. Det er vigtigt at bemærke, at inddragelse af donorblokdybde i valg af byggemetode ikke er universel. Selv om det er muligt for TMA'er at blive konstrueret ved hjælp af begge metoder uanset donorblokdybde, kan højere kerner forstyrre og eller væltes eller vippes af placeringen af plastkassetten under TMA-konstruktion ved hjælp af båndmetoden. Valget om at inkludere eller udelade kriterier i beslutningsprocessen afhænger af de faciliteter, der er tilgængelige for laboratoriet, omkostninger og det ønskede slutprodukt. Under parametrene i denne protokol er antallet af diasmonterede TMA-sektioner, der kan opnås ved hjælp af en båndmetode konstrueret TMA, betydeligt mindre end det, der opnås ved en modtagermetode konstrueret TMA. Selv om det er muligt at blokere FFPE-væv igen for at øge donorblokdybden og gøre dem kompatible med modtagermetoden, er sandsynligheden for at opnå den samme vævsorientering inden for reblokken lav. Til gengæld kan dette kræve omfattende blokvending for at opnå en fuld ansigtssektion, hvilket sandsynligvis vil omfatte betydeligt vævstab. Efter blokvending giver en båndmetode konstrueret TMA ca. 50 diasmonterede TMA-sektioner med alle kerner til stede. Det nøjagtige antal vil dog variere fra blok til blok og afhænger af længden af de kerner, der bruges til at konstruere TMA, og tykkelsen af de sektioner, der skæres (5 μm versus 4 μm). Desuden skal det også bemærkes, at kernerne på grund af deres forskellige kernelængder vil udtømme på forskellige tidspunkter, da TMA gradvist sektioneres; en egenskab, der understreger behovet for fortsat patologisk gennemgang.
Selvom modtagermetoden giver betydelige fordele og fordele i forhold til båndmetoden, herunder en mindre kedelig og hurtigere byggeprocesser, er båndmetoden ikke rettet mod erfarne laboratorier med høj kapacitet. Det er rettet mod det gennemsnitlige laboratorium, især dem i ressourcebegrænsede omgivelser, med adgang til donorblokke med variabel dybde, men ikke til TMA-byggetjenester. Fremtidige anvendelser kunne imidlertid se automatisering af denne metode for at forbedre puljen af støtteberettigede prøver i laboratorier med høj kapacitet og eliminere behovet for genblokering af donorblokke. Afslutningsvis kan den beskrevne TMA-båndmetodekonstruktionsprotokol let etableres på ikke-specialiserede laboratorier uden behov for dyrt udstyr. Det anbefales dog, at nye brugere anvender FFPE-vævsblokke uden værdi, vævsfrie farvede orienteringsværktøjer21 eller endda farvede paraffinblokke uden væv i starten for at gøre sig bekendt med båndmetodeteknikken, inden de går videre til TMA-konstruktion ved hjælp af dyrebare væv. Selvom deres konstruktion ikke er uden potentielle faldgruber, som både dem, der konstruerer og bruger TMA-blokke, bør være opmærksomme på, kan denne tilsyneladende upolerede “hjemmelavede” TMA-konstruktionsmetode give biologisk relevante TMA’er af høj kvalitet til forskning. Faktisk er TMA-sektioner, der stammer fra båndmetodekonstruerede TMA’er, blandt de mest efterspurgte vævsprøver i ACSR-biorepositoyet.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette arbejde blev ydet af nih-finansieret AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
cellSens imaging software | Olympus | x | |
Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
DP72 camera | Olympus | DP72 | |
Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
Forceps | Various | x | |
Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |