이 프로토콜은 서로 다른 깊이의 FFPE 공여체 블록을 사용하여 조직 마이크로어레이를 수동으로 구성하는 방법에 대한 테이프 방법을 간략하게 설명합니다.
조직 마이크로어레이(TMA)는 많은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플이 단일 파라핀 블록으로 표현될 수 있는 중요한 연구 도구입니다. 이것은 상이한 공여체 FFPE 블록의 관심 영역으로부터 추출된 조직 코어를 사용하여 단일 TMA 파라핀 블록으로 배열함으로써 달성된다. 일단 구축되면, 완성된 TMA로부터의 절편은 면역조직화학, 염색체형성, 형광 계내 혼성화(FISH) 및 RNA ISH 연구를 수행하여 단백질 발현뿐만 아니라 많은 샘플에서 게놈 및 전사 변화를 동시에 평가함으로써 조직 사용을 최소화하고 시약 비용을 절감할 수 있다. 여러 가지 TMA 구성 기술이 있습니다. 가장 일반적인 시공 방법 중 하나는 최소 길이 4mm가 권장되는 동일한 길이의 코어에서 가장 잘 작동하는 수용자 방법입니다. 불행히도, 조직 블록은 진단 과정에서 심하게 절제될 수 있으며, 종종 4mm 미만의 “비이상적인” 공여체 블록 두께를 초래합니다. 현재 기사 및 비디오는 양면 접착 테이프 방법에 중점을 둡니다. 이러한 비이상적인 기증자 블록과 매우 호환되는 저밀도 (<50 코어) TMA를 구성하는 대체 매뉴얼, 저렴한 비용, 사용하기 쉬운 신속한 방법. 이 프로토콜은이 방법을 사용하여 TMA를 구성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 병리학 적 검토 및 건설 후 검증의 중요한 중요성에 중점을 둡니다.
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직은 형태학적 및 면역조직화학적 단백질 발현 연구1에서 광범위하게 사용된다. 그러나 발견 연구는 종종 귀중한 조직을 배출 할 수있는 많은 수의 조직에서 여러 마커를 검사해야합니다. 1980년대에 도입된 조직 마이크로어레이(TMA)는 다양한 FFPE 조직 블록의 작은 예시적 관심 영역을 단일 파라핀 블록으로 조립하여 많은 조직 샘플을 동시에 검사할 수 있는 중요한 연구 도구입니다2. 따라서, TMA는 매우 귀중하고 종종 드문 조직 샘플의 과도한 사용을 피하면서 많은 개별 샘플(3,4)에서 다운스트림 애플리케이션을 수행하는 것과 관련된 비용을 감소시킨다.
TMAs(5)의 구축을 위한 몇 가지 상이한 기술들이 존재하며, 여기에는 자동화 및 반수동 접근법(6,7)이 포함된다. 이러한 후자의 접근법의 대부분은 수용자 방법을 사용하며, 여기서 기증자 블록으로부터 펀칭된 조직 코어는 프리캐스트 몰드에 삽입된다. 그러나 적어도 4mm 두께의 “이상적인”공여체 블록이이 방법 6,7에 사용되는 것이 좋습니다. 불행히도, 공여체 블록, 특히 연구에 이용가능하게 되기 전에 임상 진단 목적으로 광범위하게 절편화된 블록은 종종 두께가 4mm 미만이며, 이는 수용자 방법을 사용하는 TMA 구축에서의 사용에서 이들을 배제할 수 있고, 4 mm의 깊이를 달성하기 위해 재임베딩하는 경우 불가능하거나 바람직하지 않다. 또한, 이러한 절차는 종종 벤치탑 수동 조직 마이크로어레이러 또는 일반 연구 실험실에서 쉽게 접근할 수 없거나 저렴하지 않은 고가의 자동화 장비를 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 양면 접착 테이프 방법 또는 테이프 방법은, 저렴하고, 널리 이용가능하고, 재사용 가능하거나, 일회용 핸드헬드 조직 마이크로어레이기(8,9,10)를 사용하는 비이상적인 공여체 블록과 양립가능한 수동 TMA 시공 방법이다. 이 방법은 코어 길이에 관계없이 완료 시 TMA의 상단과 플러시되는 거꾸로 된 직립 코어 주위에 블록을 캐스팅하여 구성 프로세스를 반전시킵니다. 결과적으로 모든 샘플은 처음 단면화 될 때 TMA 섹션에 존재하므로 생성자가 처음부터 이러한 비 이상적인 블록을 최대한 활용할 수 있습니다. 따라서, 테이프 방법은 비전문 연구 실험실에 대한 비용 효과적이고 실현 가능한 대안을 나타냅니다.
TMA 구축은 그 도전이 없는 것은 아니며, 코어를 추출할 조직 영역을 선택할 때 주의해야 하며, 병리학적 검토가 TMA 구축 프로세스(11,12)의 중요한 부분이다. 따라서이 프로토콜은 TMA를 구성하고 사용하는 개인이 알아야 할 TMA 구축과 관련된 병리학 적 함정 중 일부와 TMA 블록의 평생 동안 병리학 적 검토가 계속되어야하는 이유를 강조함으로써 TMA 건설에서 병리학 적 검토의 심오한 중요성을 강조하는 것을 목표로합니다.
이 프로토콜은 AIDS 및 암 표본 자원 (ACSR) 기술 핵심 실험실에서 테이프 방법을 사용하여 비 이상적인 기증자 블록에서 TMA를 구성하기 위해 취한 단계를 간략하게 설명합니다. ACSR은 HIV 악성 종양 연구를 촉진하기 위해 HIV 암 조직으로부터 생물 표본의 수집 및 공평한 분배에 전념하는 NIH가 자금을 지원하는 생물 저장소입니다.
TMA 구축 공정의 가장 중요한 구성 요소 중 하나는 TMA 코어가 얻어질 FFPE 공여체 블록의 병리학 적 검토입니다4. 검토 중에 보드 인증 병리학자는 각 기증자 블록에서 대표적인 H & E 염색 조직 섹션을 검사합니다. H&E는 갓 절단한 조직 섹션을 사용하여 생성되어 해당 기증자 블록을 가장 잘 표현해야 합니다. FFPE 조직이 블록 깊이와 광범위한 단면화에 따라 조직 프로파일이 크게 바뀔 수있는 3 차원 구조라는 점을 감안할 때 오래된 H & Es의 사용은 권장되지 않습니다. 이것은 H & E가 생성 된 이후 발생했을 수 있으며, 잠재적으로 FFPE 블록의 표현이 부정확 할 수 있습니다. 검토 과정은 적절한 사례를 선택하고 코어를 얻어야하는 조직 영역을 확인하고 코어를 수집 할 때 피해야 할 영역을 식별하는 데 필수적입니다. 병리학 적 검토가없는 경우, 부적절한 조직을 포함 할 확률이 크게 증가합니다. 이러한 조직의 포함은 구축된 TMA를 비효율적이며 그것의 의도된 목적에 부적합하게 만들 가능성이 있다. 중요한 것은 이러한 비효율적 인 TMA를 무의식적으로 사용하면 허위 및 오도 된 데이터가 발생할 수있는 엄청난 잠재력을 가지고 있다는 것입니다. 이것은 FFPE 조직의 프로파일, 따라서 그들의 유도체 코어가 깊이가 증가함에 따라 크게 바뀔 수 있다는 지식과 결합하여 구성된 TMA 블록의 수명 동안 지속적인 병리학 검토의 중요성을 강조합니다. 이상적으로 H&Es는 코어의 조직 프로파일의 변화가 포착되고 기록되도록 하기 위해 매 15번째 또는 20번째 섹션마다 생성되어야 합니다. 최소한 H&Es는 프로젝트의 시작과 끝에서 생성되고 검토되어 이러한 잠재적 변화를 모니터링해야 합니다. 이러한 점과 연구 도구로서의 TMA의 중요성에 비추어 볼 때, 병리학 적 검토가 TMA 건설 과정과 TMA 블록의 수명 전반에 걸쳐 확고하게 내재되어 있어야합니다.
FFPE 블록은 종종 연구 목적으로 출시되기 전에 일상적인 진단 처리 중에 광범위하게 섹션화됩니다. 결과적으로, 공여체 블록 깊이 및 따라서 공여체 블록 코어 길이는 종종 4mm의 이상적인 수용자 방법보다 작다. 여기서 우리는 테이프 방법 구축 프로토콜을 사용하여 TMA를 구성하는 방법을 시연했으며, 그 주요 이점은 비이상적인 FFPE 조직 블록의 코어와의 호환성입니다. 테이프 방법은 연구 가치가 뛰어나고 TMA 블록을 구성하기위한 저렴하고 편리하며 접근 가능한 방법을 제공하지만 도전과 한계가없는 것은 아닙니다. 단일 TMA 블록에 100-1,000개의 코어를 수용할 수 있는 자동 및 수동 수신자 방법과 비교할 때, 테이프 방법9를 사용하여 구성된 TMA에는 최대 40개의 코어가 권장됩니다. 또 다른 한계는 시공의 용이성에 관한 것이다. 수용자 방법에서, 펀칭된 코어는 단지 프리캐스트 몰드에 삽입될 뿐이며, 이는 각각의 코어를 그 자신의 개별 웰에 케이싱함으로써 코어 안정성을 제공함으로써, 코어 마이그레이션을 방지할 뿐만 아니라 매우 규칙적인 코어 배치 및 분리(22)를 촉진한다. 또한 수신자 방법은 완전 수동, 반수동 및 완전 자동화의 선택적 편의성을 제공합니다. 반대로, 수동 테이프 방법은 바늘 선택을 사용하여 각 코어를 손으로 조심스럽게 부드럽게 배치해야합니다. 테이프 방법에 프리 캐스트 몰드가 없기 때문에 수령인 방법에 경험하는 매우 규칙적인 배치 및 분리가 배제되지만 이러한 결함은 체크 무늬 격자를 포함함으로써 극복됩니다. 블록 에지 배치를 피하기 위해 체크 무늬 그리드를 금속 트레이의 중앙에 부착하는 것이 중요하며, 이는 코어를 제자리에 고정시키는 파라핀이 충분하지 않은 경우 코어 손실의 위험을 증가시킵니다. 또한 수용자 방법으로 가능한 작은 코어 분리는 수동 코어 배치와 인접한 코어 사이에 맞추기 위해 바늘 선택이 필요하기 때문에 테이프 방법으로 달성 될 수 없다는 점에 유의해야합니다. 코어는 DSST 커버 그리드와 접촉하는 코어의 가장 작은 표면적 또는 풋프린트로 독립형 직립 방식으로 배치됩니다. 이 설정은 수용자 방법보다 훨씬 적은 코어 안정성을 제공하고 용융 파라핀을 부을 때 코어 전복 및 또는 이동에 대한 향상된 위험을 부여합니다. 실제로, 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 용융 파라핀을 붓는 것입니다. 파라핀이 완전히 액체가되고 부어가 최소한의 난기류로 부드럽게 수행되도록하기 위해 오븐에서 제거 할 때 신속하게 수행해야합니다. 흥미롭게도, Chen 등은 7 x 11 고르게 분포 된 2mm 직경의 구멍이있는 스텐실과 유사한 매우 새로운 보조 장치를 개발했는데, 이는 수용자 블록을 만들 때와 도너 블록 코어(23)를 삽입 할 때 바늘을 안내하기 위해 빈 파라핀 블록 위에 배치됩니다. 수용자 블록 건설을 돕기 위해 설계되었지만, 이러한 장치는 테이프 방법에 쉽게 적응하여 배치를 안내하고, 분리를 조절하고, 건설 프로세스 중에 코어 안정성을 높일 수 있습니다.
코어 안정성의 가장 중요한 이펙터 중 하나는 테이프 방법 TMA에 포함된 코어 수입니다. 코어 수가 증가함에 따라 증가하는 코어 수를 수용하기 위해 코어의 직경을 줄여야 하며, 이로 인해 DSST에 부착되는 코어 풋프린트가 줄어들기 때문입니다. 테이프 방식 TMA 구축에는 최소 코어 직경 1mm가 권장되는데, 직경이 작은 코어는 특히 불안정하고 매우 부드러운 파라핀이 쏟아져 나오더라도 무너지기 쉽다는 것을 발견했습니다. 16G 바늘 (코어 직경 1.1mm)과 직경 4mm 펀치를 사용한 두 가지 사내 방법을 조사한 최근 연구에 따르면 4mm 코어 24가 아닌 1.1mm (26.5 %)의 상당한 조직손실이 발생했습니다. 이것은 작은 코어가 건설 중뿐만 아니라 함께 작업하는 데 문제가 될 수 있음을 나타내는 것으로 보입니다. 더욱이, 더 작은 직경은 원래의 기증자 블록뿐만 아니라 더 큰 코어를 나타내지 않을 수 있으며, 병리학 적 해석을 어렵게 만들고 부정확 한 기증자 조직 표현의 가능성을 증가시킵니다.
방향 블록의 포함 및 배치는 TMA 구성에서 매우 중요합니다. 그러나 이것은 TMA를 구성하는 테이프 방법에 특히 중요합니다. 이것은 테이프 방법이 건설 프로세스를 반전시켜 공간 방향 감각 상실의 위험을 증가시킨다는 사실에서 비롯됩니다. 모든 블록에 최대 세 개의 방향 코어를 포함하고 블록 방향을 가장 잘 맞추기 위해 샘플 코어에서 멀리 배치하는 것이 좋습니다. 배향 코어는 구축된 TMA 또는 조직-무색-착색 배향 도구(21)의 주제로부터 뚜렷하게 상이한 조직을 함유하는 조직 블록으로부터 취해진 코어일 수 있으며, 여기서 후자는 비병리학자에게 특히 유용하다. 비정규 매트릭스 패턴화된 코어 배치와 결합하여, 방향 코어는 방향 방향 상실의 위험을 최소화합니다.
테이프와 수령인 방법을 사용하여 구성된 TMA 간의 코어 길이의 뚜렷한 차이는 건설 방법을 선택할 때 의사 결정 프로세스에 기증자 블록 깊이를 포함시키는 데서 비롯됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 공여체 블록의 깊이가 각각 <4mm 및 4mm일 때 테이프 및 수용자 방법을 사용하여 TMA를 구성하는 임계값을 사용합니다. 건설 방법 선택에 기증자 블록 깊이를 포함시키는 것이 보편적 인 것은 아니라는 점에 유의해야합니다. TMA는 도너 블록 깊이에 관계없이 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 구성 할 수 있지만 키가 큰 코어는 테이프 방법을 사용하여 TMA 시공 중에 플라스틱 카세트의 배치를 방해하거나 전복하거나 기울어 질 수 있습니다. 의사 결정 과정에서 기준을 포함하거나 생략하는 선택은 실험실에서 사용할 수있는 편의 시설, 비용 및 원하는 최종 제품에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 파라미터 하에서, 구성된 TMA를 테이프 방법으로부터 얻을 수 있는 슬라이드 장착형 TMA 섹션의 수는 수용자 방식으로 구성된 TMA로부터 수득된 것보다 상당히 적다. FFPE 조직을 재차단하여 공여자 블록 깊이를 증가시키고 수용자 방법과 호환되도록 할 수 있지만, 재차단 내에서 동일한 조직 배향을 달성할 확률은 낮다. 차례로, 이것은 전면 절편을 얻기 위해 광범위한 대면 블록을 필요로 할 수 있으며, 이는 상당한 조직 손실을 포함 할 가능성이 큽니다. 블록 직면 후, TMA로 구성된 테이프 방법은 모든 코어가 존재하는 약 50개의 슬라이드 장착 TMA 섹션을 생성합니다. 그러나 정확한 수는 블록마다 다르며 TMA를 구성하는 데 사용되는 코어의 길이와 절단되는 섹션의 두께 (5 μm 대 4 μm)에 따라 다릅니다. 또한, 코어 길이가 다르기 때문에 TMA가 점진적으로 단면화됨에 따라 코어가 다른 시간에 배출된다는 점에 유의해야합니다. 지속적인 병리학 적 검토의 필요성을 다시 강조하는 속성.
수신자 방법은 덜 지루하고 신속한 건설 프로세스를 포함하여 테이프 방법에 비해 상당한 이점과 이점을 제공하지만 테이프 방법은 경험이 풍부한 높은 처리량의 실험실을 대상으로하지 않습니다. 그것은 평균 실험실, 특히 자원이 제한된 설정에있는 실험실을 대상으로하며, 가변 깊이의 기증자 블록에 액세스 할 수 있지만 TMA 건설 서비스에는 액세스 할 수 없습니다. 그러나 향후 응용 분야에서는 고처리량 실험실에서 적격 샘플 풀을 강화하고 기증자 블록의 재차단 필요성을 없애기 위해이 방법의 자동화를 볼 수 있습니다. 결론적으로, 설명된 TMA 테이프 방법 구축 프로토콜은 고가의 장비 없이도 비전문 실험실에서 쉽게 확립될 수 있다. 그러나, 새로운 사용자는 귀중한 조직을 이용한 TMA 구축으로 발전하기 전에 테이프 방법 기술에 익숙해지기 위해 처음에는 가치가 없는 FFPE 조직 블록, 무조직 착색 배향 도구(21 ) 또는 심지어 조직이 없는 착색된 파라핀 블록을 사용해야 한다는 것이 권고된다. TMA 블록을 건설하고 사용하는 사람들 모두가 알아야 할 잠재적 인 함정이없는 것은 아니지만,이 겉으로보기에는 연마되지 않은 “수제”TMA 건설 방법은 연구를 위해 고품질의 생물학적으로 관련된 TMA를 산출 할 수 있습니다. 실제로, 테이프 방식으로 구성된 TMA에서 유래한 TMA 절편은 ACSR 생물저장소에서 가장 많이 요구되는 조직 샘플 중 하나입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업에 대한 기금은 NIH가 자금을 지원하는 AIDS 및 암 표본 자원 (ACSR) 생물 저장소 (www.acsr1.com), UM1CA181255에 의해 제공되었습니다.
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