Detta protokoll beskriver tejpmetoden för hur man manuellt konstruerar en vävnadsmikroarray med FFPE-givarblock med olika djup.
Vävnadsmikroarray (TMA) är ett viktigt forskningsverktyg där många formalin fixerade paraffininbäddade (FFPE) prover kan representeras i ett enda paraffinblock. Detta uppnås genom att använda vävnadskärnor extraherade från regionen av intresse för olika givar-FFPE-block och ordna dem i ett enda TMA-paraffinblock. När de väl har konstruerats kan sektioner från den färdiga TMA användas för att utföra immunohistokemi, kromogena, fluorescens in situ hybridisering (FISH) och RNA ISH-studier för att bedöma proteinuttryck samt genomiska och transkriptionella förändringar i många prover samtidigt, vilket minimerar vävnadsanvändningen och minskar reagenskostnaderna. Det finns flera olika TMA-konstruktionstekniker. En av de vanligaste konstruktionsmetoderna är mottagarmetoden, som fungerar bäst med kärnor av samma längd för vilka en minsta längd på 4 mm rekommenderas. Tyvärr kan vävnadsblock kraftigt resekeras under diagnosprocessen, vilket ofta resulterar i “icke-idealiska” givarblocktjocklekar på mindre än 4 mm. Den aktuella artikeln och videon fokuserar på den dubbelsidiga tejpmetoden; en alternativ manuell, låg kostnad, lätt att använda och snabb metod för att konstruera TMA med låg densitet (<50 kärnor) som är mycket kompatibel med dessa icke-idealiska givarblock. Detta protokoll ger en steg-för-steg-guide om hur man konstruerar en TMA med hjälp av denna metod, med fokus på den kritiska betydelsen av patologisk granskning och validering efter konstruktion.
Formalin fixerade paraffin inbäddade (FFPE) vävnader används i stor utsträckning i morfologiska och immunohistokemiska proteinuttrycksstudier1. Upptäcktsforskning kräver emellertid ofta undersökning av flera markörer på ett stort antal vävnader, vilket kan uttömma värdefulla vävnader. Vävnadsmikroarrayen (TMA) introducerades på 1980-talet och är ett viktigt forskningsverktyg som samlar små exemplifierande regioner av intresse från många olika FFPE-vävnadsblock till ett enda paraffinblock, vilket möjliggör undersökning av många vävnadsprover samtidigt2. TMA undviker således överdriven användning av mycket värdefulla och ofta sällsynta vävnadsprover samtidigt som kostnaderna för att utföra nedströmsapplikationer på många enskilda prover 3,4 minskar.
Det finns flera olika tekniker för konstruktion av TMA5, inklusive automatiserade och halvmanuella metoder 6,7. Majoriteten av dessa senare metoder använder mottagarmetoden, där vävnadskäror stansade från givarblock sätts in i en prefabricerad form. Det rekommenderas dock att “idealiska” givarblock som är minst 4 mm tjocka används för denna metod 6,7. Tyvärr är givarblock, särskilt de som i stor utsträckning har sektionerats för kliniska diagnostiska ändamål innan de görs tillgängliga för forskning, ofta mindre än 4 mm tjocka, vilket kan utesluta dem från användning i TMA-konstruktion med mottagarmetoden, om ombäddning för att uppnå ett djup på 4 mm inte är möjligt eller önskvärt. Dessutom kan dessa procedurer ofta använda en bänkskiva manuell vävnadsmikroarrayer eller dyra automatiserade instrument som inte är lättillgängliga eller överkomliga för det genomsnittliga forskningslaboratoriet. Däremot är den dubbelsidiga tejpmetoden eller tejpmetoden en manuell TMA-konstruktionsmetod som är kompatibel med icke-idealiska givarblock som använder billiga, allmänt tillgängliga, återanvändbara eller engångshandhållna vävnadsmikroarrayer 8,9,10. Denna metod inverterar byggprocessen genom att gjuta blocket runt inverterade upprättstående kärnor som vid färdigställande är i linje med toppen av TMA, oavsett kärnlängd. Som ett resultat är alla prover närvarande i TMA-sektioner när de först sektioneras, vilket gör det möjligt för konstruktören att få ut det mesta av dessa icke-idealiska block från början. Således representerar bandmetoden ett kostnadseffektivt och genomförbart alternativ för de icke-specialiserade forskningslaboratorierna.
TMA-konstruktion är inte utan utmaningar, och försiktighet måste vidtas vid val av vävnadsregioner för att extrahera kärnorna från, vilket gör patologisk granskning till en kritisk del av TMA-byggprocessen11,12. Således syftar detta protokoll till att understryka den djupa betydelsen av patologisk granskning i TMA-konstruktion genom att lyfta fram några av de patologiska fallgroparna i samband med TMA-konstruktion som individer som konstruerar och använder TMA bör vara medvetna om, och varför patologigranskning bör fortsätta under livslängden för ett TMA-block.
Detta protokoll beskriver de steg som vidtagits vid AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory för att konstruera TMA från icke-idealiska givarblock med hjälp av tejpmetoden; där ACSR är ett NIH-finansierat biorepository som är dedikerat till insamling och rättvis fördelning av biospecimens från HIV-cancervävnader för att främja HIV-malignitetsforskning.
En av de mest kritiska komponenterna i TMA-byggprocessen är patologisk granskning av FFPE-givarblock från vilka TMA-kärnorna kommer att erhållas4. Under granskningen undersöker en styrelsecertifierad patolog en representativ H&E-färgad vävnadssektion från varje givarblock. Det är absolut nödvändigt att H&E genereras med hjälp av en nyskuren vävnadssektion så att den är den bästa representationen av motsvarande givarblock. Användning av äldre H&Es rekommenderas inte med tanke på att FFPE-vävnader är 3-dimensionella strukturer vars vävnadsprofil kan förändras avsevärt med blockdjup och omfattande sektionering. Detta kan ha inträffat sedan H&E genererades, vilket kan göra dess representation av FFPE-blocket felaktig. Översynsprocessen är avgörande för valet av lämpliga fall och identifiering av vävnadsområden från vilken kärnor bör erhållas, samt identifiering av områden som bör undvikas vid insamling av kärnor. I avsaknad av patologisk granskning ökar sannolikheten för att inkludera olämpliga vävnader signifikant. Införandet av sådana vävnader har potential att göra den konstruerade TMA ineffektiv och olämplig för sitt avsedda ändamål. Det är viktigt att omedvetet använda sådana ineffektiva TMA har en enorm potential att resultera i falska och vilseledande uppgifter. Detta i kombination med vetskapen om att profilen för FFPE-vävnader, och därmed deras derivatkärnor, kan förändras avsevärt med ökande djup belyser vikten av fortsatt patologigranskning under hela livslängden för ett konstruerat TMA-block. Helst bör H&Es genereras med hjälp av varje 15: e eller 20: e sektion för att säkerställa att eventuella förändringar i kärnornas vävnadsprofiler fångas upp och registreras. Som ett minimum bör H&Es genereras och granskas i början och slutet av ett projekt för att övervaka dessa potentiella förändringar. Mot bakgrund av dessa punkter och vikten av TMA som ett forskningsverktyg är det absolut nödvändigt att den patologiska granskningen är fast inbäddad i TMA-byggprocessen och under hela TMA-blockets livslängd.
FFPE-block är ofta i stor utsträckning sektionerade under rutinmässig diagnostisk bearbetning innan de släpps för forskningsändamål. Som ett resultat är givarblockdjupet och därmed givarblockkärnlängderna ofta mindre än mottagarmetodens ideal på 4 mm. Här har vi visat hur man konstruerar TMA med hjälp av konstruktionsprotokollet för bandmetoden, vars främsta fördel är dess kompatibilitet med kärnor från icke-idealiska FFPE-vävnadsblock. Även om bandmetoden är av stort forskningsvärde och erbjuder en billig, bekväm och tillgänglig metod för att konstruera TMA-block, är den inte utan utmaningar och begränsningar. Jämfört med både automatiserade och manuella mottagarmetoder, som rymmer 100-1000-tals kärnor i ett enda TMA-block, rekommenderas maximalt 40 kärnor för TMA konstruerade med bandmetod9. En annan begränsning är med avseende på enkel konstruktion. I mottagarmetoden sätts stansade kärnor bara in i en prefabricerad form, vilket ger kärnstabilitet genom att innesluta varje kärna i sin egen individuella brunn, vilket förhindrar kärnmigrering samt främjar mycket regelbunden kärnplacering och separation22. Dessutom erbjuder mottagarmetoden den valfria bekvämligheten att vara helt manuell, halvmanuell och helt automatiserad. Däremot kräver den manuella tejpmetoden noggrann, skonsam placering av varje kärna för hand med hjälp av en nålplockning. Även om frånvaron av en prefabricerad form i tejpmetoden utesluter den mycket regelbundna placeringen och separationen som upplevs med mottagarmetoden, övervinns denna brist genom införandet av ett rutigt rutnät. Det är viktigt att det rutiga gallret fästs i mitten av metallbrickan för att undvika blockkantsplacering, vilket ökar risken för kärnförlust om det inte finns tillräckligt med paraffin som håller kärnan på plats. Det måste också noteras att de små kärnseparationer som är möjliga med mottagarmetoden inte kan uppnås med tejpmetoden på grund av manuell kärnplacering och behovet av att nålplockningen passar mellan intilliggande kärnor. Kärnor placeras på ett fristående upprätt sätt med den minsta ytan eller fotavtrycket av kärnan som kommer i kontakt med det DSST-täckta gallret. Denna inställning ger betydligt mindre kärnstabilitet än mottagarmetoden och ger en ökad risk för kärnstoppning och/eller migrering vid hällning av det smälta paraffinet. Faktum är att ett av de mest kritiska stegen i protokollet häller det smälta paraffinet. Det är viktigt att detta görs snabbt vid borttagning från ugnen för att säkerställa att paraffinet är helt flytande och att hällen utförs försiktigt med minimal turbulens. Intressant nog utvecklade Chen et al. en mycket ny hjälpanordning, besläktad med en stencil med 7 x 11 jämnt fördelade hål med en diameter på 2 mm, som placeras ovanpå ett tomt paraffinblock för att styra nålar när man skapar mottagarblocket och när man sätter in givarblockkärnorna23. Även om den är utformad för att underlätta konstruktionen av mottagarblock, kan en sådan anordning enkelt anpassas till tejpmetoden för att styra placeringen, reglera separationen och öka kärnstabiliteten under byggprocessen.
En av de viktigaste effektorerna av kärnstabilitet är antalet kärnor som ingår i en bandmetod TMA. Detta beror på att när antalet kärnor ökar måste kärnans diameter minska för att rymma det ökande antalet kärnor, vilket i sin tur minskar kärnavtrycket som följer DSST. En minsta kärndiameter på 1 mm rekommenderas för tejpmetod TMA-konstruktion, eftersom vi har funnit att kärnor med mindre diametrar är särskilt instabila och benägna att välta även med mycket mild paraffinhällning. En nyligen genomförd studie som undersökte två olika interna metoder som använde 16 G-nålar (kärndiameter på 1,1 mm) och en stans med en diameter på 4 mm upplevde betydande vävnadsförluster med 1,1 mm (26,5%) men inte 4 mm-kärnorna24. Detta verkar tyda på att små kärnor kan vara problematiska att arbeta med och inte bara under konstruktionen. Dessutom kan mindre diametrar inte representera det ursprungliga givarblocket såväl som större kärnor, vilket gör patologisk tolkning svår och ökar sannolikheten för felaktig donatorvävnadsrepresentation.
Inkludering och placering av orienteringsblock är av stor betydelse vid TMA-konstruktion. Detta är dock av särskild betydelse för bandmetodkonstruerade TMA. Detta härrör från det faktum att tejpmetoden inverterar byggprocessen och därmed ökar risken för rumslig desorientering. Vi rekommenderar att du inkluderar upp till tre orienteringskärlor i varje block och att de placeras bort från provkärnorna för att bäst orientera blocket. Orienteringskärlor kan vara kärnor hämtade från vävnadsblock som innehåller tydligt olika vävnader från temat för de konstruerade TMA- eller vävnadsfria färgade orienteringsverktygen21, där det senare är särskilt användbart för icke-patologer. I kombination med icke-regelbunden matrismönstrad kärnplacering minimerar orienteringskärnor risken för desorientering.
Den uttalade skillnaden i kärnlängd mellan TMA konstruerade med tejp- och mottagarmetoder härrör från inkludering av givarblockdjup i beslutsprocessen vid val av konstruktionsmetod. Protokollet som beskrivs här använder ett tröskelvärde där TMA konstrueras med hjälp av tejp- och mottagarmetoderna när givarblocken har djup på <4 mm respektive 4 mm. Det är viktigt att notera att inkludering av givarblockdjup i valet av konstruktionsmetod inte är universellt. Även om det är möjligt för TMA att konstrueras med endera metoden oavsett givarblockdjup, kan högre kärnor störa och eller vältas eller lutas av placeringen av plastkassetten under TMA-konstruktion med tejpmetoden. Valet att inkludera eller utelämna kriterier i beslutsprocessen beror på de bekvämligheter som är tillgängliga för laboratoriet, kostnaden och den önskade slutprodukten. Enligt parametrarna i detta protokoll är antalet glidmonterade TMA-sektioner som kan erhållas från en bandmetod konstruerad TMA betydligt mindre än det som erhålls från en mottagarmetod konstruerad TMA. Även om det är möjligt att återblockera FFPE-vävnader för att öka givarblockdjupet och göra dem kompatibla med mottagarmetoden, är sannolikheten för att uppnå samma vävnadsorientering inom reblocket låg. I sin tur kan detta kräva omfattande blockvändning för att få en full-face sektion, vilket sannolikt skulle innefatta betydande vävnadsförlust. Efter blockvändning ger en tejpmetod konstruerad TMA cirka 50 glidmonterade TMA-sektioner med alla kärnor närvarande. Det exakta antalet varierar dock från block till block och beror på längden på kärnorna som används för att konstruera TMA och tjockleken på sektionerna som skärs (5 μm mot 4 μm). Dessutom måste det också noteras att på grund av deras olika kärnlängder kommer kärnorna att tömmas vid olika tidpunkter när TMA gradvis delas upp; ett attribut som på ett återbetonar behovet av fortsatt patologisk granskning.
Även om mottagarmetoden erbjuder betydande fördelar och fördelar jämfört med bandmetoden, inklusive en mindre tråkig och snabbare byggprocesser, riktar sig bandmetoden inte till erfarna laboratorier med hög genomströmning. Det riktar sig till det genomsnittliga laboratoriet, särskilt de i resursbegränsade miljöer, med tillgång till givarblock med varierande djup men inte till TMA-byggtjänster. Framtida tillämpningar skulle dock kunna leda till automatisering av denna metod för att förbättra poolen av stödberättigande prover i laboratorier med hög genomströmning och eliminera behovet av att återblockera givarblock. Sammanfattningsvis kan TMA-bandmetodens konstruktionsprotokoll enkelt upprättas vid icke-specialiserade laboratorier utan behov av dyr utrustning. Det rekommenderas dock att nya användare bör använda FFPE-vävnadsblock utan värde, vävnadsfria färgade orienteringsverktyg21 eller till och med färgade paraffinblock utan vävnad först för att bekanta sig med tejpmetodtekniken innan de går vidare till TMA-konstruktion med hjälp av dyrbara vävnader. Även om deras konstruktion inte är utan potentiella fallgropar, vilket både de som konstruerar och använder TMA-block bör vara medvetna om, kan denna till synes opolerade “hemlagade” TMA-konstruktionsmetod ge högkvalitativa, biologiskt relevanta TMA för forskning. Faktum är att TMA-sektioner som härrör från bandmetod konstruerade TMA är bland ett av de mest efterfrågade vävnadsproverna i ACSR-biorepositoriet.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för detta arbete tillhandahölls av NIH-finansierade AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
cellSens imaging software | Olympus | x | |
Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
DP72 camera | Olympus | DP72 | |
Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
Forceps | Various | x | |
Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |