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Biochimie

Dosage de la glycosylase uracile-ADN par désorption laser assistée par matrice / ionisation Analyse par spectrométrie de masse au temps de vol

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Une méthode non marquée et non radio-isotopique pour tester l’activité de l’uracile-ADN glycosylase a été mise au point à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour l’analyse directe du produit contenant un site apurinique/apyrimidinique. Le test s’est avéré assez simple, spécifique, rapide et facile à utiliser pour la mesure de l’ADN glycosylase.

Abstract

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) est un composant clé de la voie de réparation de l’excision de base pour la correction de l’uracile formé à partir de la désamination hydrolytique de la cytosine. Ainsi, il est crucial pour le maintien de l’intégrité du génome. Une méthode très spécifique, non étiquetée et non radio-isotopique a été développée pour mesurer l’activité UDG. Un duplex d’ADN synthétique contenant un uracile spécifique au site a été clivé par UDG, puis soumis à une analyse de spectrométrie de masse à temps de vol MALDI-TOF MS (MalDI-TOF MS) assistée par laser assistée par matrice. Un protocole a été établi pour préserver le produit du site purinique/apyrimidinique (AP) dans l’ADN sans rupture de brin. La variation de la valeur m/z du substrat au produit a été utilisée pour évaluer l’hydrolyse de l’uracile par UDG. Un substrat G:U a été utilisé pour l’analyse cinétique UDG donnant le Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s et Kcat = 9,31 s-1. L’application de cette méthode à un essai d’inhibiteur de l’uracile glycosylase (UGI) a donné une valeur IC50 de 7,6 pM. La spécificité de l’UDG utilisant l’uracile à différentes positions dans les substrats d’ADN simple brin et double brin a démontré différentes efficacités de clivage. Ainsi, cette méthode SIMPLE, rapide et polyvalente MALDI-TOF MS pourrait être une excellente méthode de référence pour diverses glycosylases d’ADN monofonctionnelles. Il a également le potentiel d’être un outil pour le dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

Introduction

Bien que l’uracile soit une base normale dans l’ARN, il s’agit d’une lésion commune et hautement mutagène dans l’ADN génomique. L’uracile peut résulter d’une désamination hydrolytique spontanée/enzymatique d’une désoxycytidine. Dans chaque cellule vivante, cette désamination se produit 100 à 500 fois par jour dans des conditions physiologiques1,2. Si ces altérations ne sont pas réparées, il peut y avoir un changement dans la composition de la séquence d’ADN, provoquant une mutation. Comme l’uracile dans l’ADN préfère s’apparier avec le dATP pendant la réplication, si la cytosine se désamine en uracile, dans deux événements de réplication, il y aura une nouvelle mutation de transition G:C à A:T dans la moitié de l’ADN de la descendance3.

Parmi les stratégies cellulaires pour maintenir la stabilité génétique, la réparation de l’excision de base (BER) est un mécanisme essentiel qui répare les bases endommagées, telles que l’uracile, dans l’ADN4. Le BER est un processus hautement conservé sur le plan de l’évolution. Il existe deux voies BER générales : la voie à patch court menant à un tractus de réparation d’un seul nucléotide et la voie à long patch qui produit un tractus de réparation d’au moins deux nucléotides5. Le BER est un mécanisme coordonné qui se déroule en plusieurs étapes. La première étape du BER est l’hydrolyse enzymatique de la base nucléotidique endommagée par une glycosylase d’ADN spécifique aux dommages pour générer un site intermédiaire purinique/apyrimidinique (AP)6. Ceci est suivi par le clivage de l’épine dorsale sucre-phosphate sur le site AP par une endonucléase, le nettoyage des extrémités de l’ADN par une lyase, le remplissage de l’espace par une ADN polymérase et le scellement de l’entaille finale par une ligase5.

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) hydrolyse l’uracile à partir de l’ADN contenant de l’uracile pour le BER chez Escherichia coli. Les tests UDG conventionnels utilisant de l’ADN radiomarqué impliquant différentes techniques de séparation6,7,8,9,10,11,12,13 prennent généralement beaucoup de temps, demandent beaucoup de main-d’œuvre, avec des réactifs d’étiquetage coûteux, des procédures compliquées et nécessitent une formation et une pratique intensives pour réduire les risques d’exposition aux matières radioactives. Des dosages fluorométriques d’oligonucléotides ont été développés en remplacement du marquage des radio-isotopes14, en plus des balises moléculaires et de la technologie de transfert d’énergie par résonance de Förster15,16,17,18,19,20. Cependant, un étiquetage spécifique est requis pour toutes les méthodes susmentionnées. Récemment, des tests de biocapteurs sans étiquette21,22,23 et des méthodes colorimétriques basées sur la formation d’un G-quadruplex24,25,26 ont été développés. Cependant, plusieurs paires A:U ou séquences spécialement conçues dans les sondes compliquent la définition de l’unité enzymatique.

MALDI-TOF MS est une technologie qui pourrait être d’une grande utilité dans l’analyse de l’ADN. Les applications développées comprennent le génotypage du polymorphisme mononucléotidique27,28, l’analyse de nucléotides modifiés29 et l’identification intermédiaire de réparation de l’ADN30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS devrait être facilement adopté pour l’analyse de l’ADN glycosylase afin de détecter les produits d’ADN contenant du site AP. Cependant, les sites AP dans l’ADN sont sujets à la rupture des brins dans de nombreuses conditions expérimentales33. Un test UDG est présenté ici en utilisant MALDI-TOF MS pour mesurer directement la production du site AP sans bruit de rupture de brin significatif. Cette méthode sans étiquette est facile à utiliser et présente un potentiel élevé pour l’application pharmaceutique du dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

Protocol

1. Préparation du substrat/gabarit Concevez un substrat d’uracile / gabarit duplex avec une teneur équilibrée en G + C d’environ 50 ± 10% et une température de fusion minimale de 50 ° C pour la région duplex.REMARQUE : Une différence de nucléotide entre les substrats de 18 nt et les gabarits de 19 nt (tableau 1 et figure 1) permet une meilleure interprétation du signal MS et un recuit approprié. Le brin modèle sert d’ADN compl…

Representative Results

Modèles et substratsEn prenant des oligonucléotides synthétiques avec U au centre (U + 9) associés à un gabarit G à titre d’exemple (Figure 1A), un contrôle à blanc des quantités équimolaires de substrat contenant du gabarit et de l’uracile peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de la pureté des oligonucléotides synthétiques (Figure 1B; les signaux correspondent au m / z désigné et au faible bruit de fond). P…

Discussion

Cet article fournit une procédure détaillée pour l’utilisation d’une méthode de dosage UDG MALDI-TOF MS pour détecter directement les produits d’ADN contenant de l’AP. Les principaux avantages de cette méthode sont que les substrats contenant de l’uracile sont sans étiquette, évolutifs, faciles à travailler et offrent une plus grande flexibilité dans la conception du substrat.

L’extraction phénol/chloroforme recommandée par le fournisseur UDG permet l’inactivation de …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Centre intégré de génomique fonctionnelle du NCFPB (Taipei, Taïwan) et le Laboratoire de pharmacogénomique du NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan, R.O.C. [numéro de subvention MOST109-2314-B-002 -186 à K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 à S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 à W.-h.F.]. H.-L.C. est récipiendaire d’une bourse de doctorat de l’Université nationale de Taiwan. Financement de la redevance pour le libre accès : Ministère des sciences et de la technologie, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
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References

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Keywords: Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
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Citer Cet Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
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