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Biochimie

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Abstract

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) ist eine Schlüsselkomponente im Reparaturweg der Basenexzision zur Korrektur von Uracil, das durch hydrolytische Desaminierung von Cytosin gebildet wird. Daher ist es entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität. Zur Messung der UDG-Aktivität wurde eine hochspezifische, nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode entwickelt. Ein synthetisches DNA-Duplex, das ein ortsspezifisches Uracil enthielt, wurde von UDG gespalten und dann einer matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (MALDI-TOF MS) unterzogen. Es wurde ein Protokoll erstellt, um das Produkt der apurinischen / apyrimidinischen Stelle (AP) in der DNA ohne Strangbruch zu erhalten. Die Änderung des m/z-Wertes vom Substrat zum Produkt wurde genutzt, um die Uracilhydrolyse mittels UDG zu bewerten. Für die kinetische UDG-Analyse wurde ein G:U-Substrat verwendet, das Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s und Kcat = 9,31 s-1 ergibt. Die Anwendung dieser Methode auf einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI)-Assay ergab einen IC50-Wert von 7,6 pM. Die UDG-Spezifität unter Verwendung von Uracil an verschiedenen Positionen innerhalb von einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Substraten zeigte unterschiedliche Spaltungseffizienzen. Somit könnte diese einfache, schnelle und vielseitige MALDI-TOF MS-Methode eine ausgezeichnete Referenzmethode für verschiedene monofunktionelle DNA-Glykosylasen sein. Es hat auch das Potenzial als Werkzeug für das DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screening.

Introduction

Obwohl Uracil eine normale Base in RNA ist, ist es eine häufige und hochgradig mutagene Läsion in der genomischen DNA. Uracil kann durch spontane/enzymatische hydrolytische Desaminierung eines Desoxycytidins entstehen. In jeder lebenden Zelle tritt diese Desaminierung 100-500 Mal pro Tag unter physiologischen Bedingungen auf1,2. Wenn diese Veränderungen nicht repariert werden, kann es zu einer Veränderung der DNA-Sequenzzusammensetzung kommen, die zu einer Mutation führt. Da Uracil in der DNA es vorzieht, sich während der Replikation mit dATP zu paaren, wenn Cytosin zu Uracil deaminiert, wird es in zwei Replikationsereignissen eine neue G: C zu A: T-Übergangsmutation in der Hälfte der Nachkommen DNA3 geben.

Unter den zellulären Strategien zur Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist die Base Excision Repair (BER) ein wesentlicher Mechanismus, der beschädigte Basen wie Uracil in DNA4 repariert. Der BER ist ein hochgradig evolutionär konservierter Prozess. Es gibt zwei allgemeine BER-Signalwege: den Kurzfeldweg, der zu einem Reparaturtrakt eines einzelnen Nukleotids führt, und den Langfeldweg, der einen Reparaturtrakt von mindestens zwei Nukleotiden erzeugt5. Der BER ist ein koordinierter Mechanismus, der in mehreren Schritten erfolgt. Der erste Schritt im BER ist die enzymatische Hydrolyse der geschädigten Nukleotidbase durch eine schadensspezifische DNA-Glykosylase zur Erzeugung einer apurinisch/apyrimidinischen (AP) Zwischenstelle6. Es folgt die Spaltung des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der AP-Stelle durch eine Endonuklease, die Reinigung der DNA-Endung durch eine Lyase, die Lückenfüllung durch eine DNA-Polymerase und die Versiegelung des letzten Nicks durch eine Ligase5.

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) hydrolysiert das Uracil aus Uracil-haltiger DNA für BER in Escherichia coli. Herkömmliche UDG-Assays mit radioaktiv markierter DNA mit unterschiedlichen Trenntechniken6,7,8,9,10,11,12,13 sind in der Regel zeitaufwendig, arbeitsintensiv, mit kostspieligen Markierungsreagenzien, komplizierten Verfahren und erfordern intensive Schulungen und Übungen, um das Risiko einer Exposition gegenüber radioaktiven Stoffen zu reduzieren. Fluorometrische Oligonukleotid-Assays wurden als Ersatz für die Radioisotopenmarkierung14 entwickelt, zusätzlich zu molekularen Beacons und Förster-Resonanzenergieübertragungstechnologie15,16,17,18,19,20. Für alle oben genannten Methoden ist jedoch eine spezifische Kennzeichnung erforderlich. Kürzlich wurden markierungsfreie Biosensor-Assays21,22,23 und kolorimetrische Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines G-Quadruplex24,25,26 basieren. Mehrere A:U-Paare oder speziell entwickelte Sequenzen in den Sonden erschweren jedoch die Definition der Enzymeinheit.

MALDI-TOF MS ist eine Technologie, die bei der DNA-Analyse von großem Nutzen sein könnte. Zu den entwickelten Anwendungen gehören die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung27,28, die modifizierte Nukleotidanalyse29 und die DNA-Reparatur-Zwischenidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS sollte leicht für die DNA-Glykosylase-Analyse eingesetzt werden, um AP-Site-haltige DNA-Produkte nachzuweisen. AP-Stellen in der DNA sind jedoch unter vielen experimentellen Bedingungen anfällig für Strangbrüche33. Hier wird ein UDG-Assay vorgestellt, der MALDI-TOF MS verwendet, um die AP-Standortproduktion ohne signifikantes Strangbruchrauschen direkt zu messen. Diese markierungsfreie Methode ist einfach zu bedienen und hat ein hohes Potenzial für die pharmazeutische Anwendung des DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screenings.

Protocol

1. Substrat-/Vorlagenvorbereitung Entwerfen Sie Uracil-Substrat / Template-Duplex mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt von ~ 50 ± 10% und einer minimalen Schmelztemperatur von 50 ° C für den Duplexbereich.HINWEIS: Ein Nukleotidunterschied zwischen 18 nt-Substraten und 19 nt-Schablonen (Tabelle 1 und Abbildung 1) trägt zu einer besseren MS-Signalinterpretation und einem geeigneten Glühen bei. Der Template-Strang dient als komplementäre DNA …

Representative Results

Schablonen und SubstrateAm Beispiel synthetischer Oligonukleotide mit U in der Mitte (U+9) gepaart mit einer G-Schablone (Abbildung 1A) kann eine Leerkontrolle der äquimolaren Mengen an Schablone und Uracil-haltigem Substrat zur Qualitätskontrolle der Reinheit synthetischer Oligonukleotide verwendet werden (Abbildung 1B; die Signale stimmen mit dem angegebenen m/z und dem geringen Hintergrundrauschen überein). Für die MS-Datenanalyse wur…

Discussion

Dieses Papier bietet ein detailliertes Verfahren für die Verwendung einer UDG MALDI-TOF MS-Assay-Methode zum direkten Nachweis von AP-haltigen DNA-Produkten. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass Uracil-haltige Substrate markierungsfrei, skalierbar, einfach zu verarbeiten sind und eine größere Flexibilität im Substratdesign bieten.

Die vom UDG-Lieferanten empfohlene Phenol/Chloroform-Extraktion ermöglicht die Inaktivierung des Enzyms, um den Abbau der Produkt-DNA zu verhin…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und dem NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, R.O.C. unterstützt [Fördernummer MOST109-2314-B-002 -186 an K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 an S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 an W.-h.F.]. H.-L.C. ist Stipendiat der National Taiwan University. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: Ministerium für Wissenschaft und Technologie, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
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References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochimie. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochimie. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochimie. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

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Keywords: Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
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Citer Cet Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
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