JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Анализ урацил-ДНК-гликозилазы с помощью матрицы лазерной десорбции/ионизации Масс-спектрометрии времени пролета

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Немаркированный, нерадиоизотопный метод анализа активности урацил-ДНК-гликозилазы был разработан с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF для прямого анализа апуринового/апиримидинического сайта,содержащего продукт. Анализ оказался довольно простым, специфическим, быстрым и удобным в использовании для измерения ДНК-гликозилазы.

Abstract

Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) является ключевым компонентом в базовом пути иссечения для коррекции урацила, образующегося в результате гидролитического дезаминирования цитозина. Таким образом, это имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Для измерения активности UDG был разработан высокоспецифичный, немаркированный, нерадиоизотопный метод. Синтетический дуплекс ДНК, содержащий сайт-специфический урацил, был расщеплен UDG, а затем подвергнут анализу лазерной десорбции / ионизации во время полета (MALDI-TOF MS). Был установлен протокол для сохранения продукта апуринового/апиримидинового сайта (AP) в ДНК без разрыва цепи. Изменение значения m/z от субстрата к продукту использовалось для оценки гидролиза урацила UDG. Субстрат G:U использовался для кинетического анализа UDG, в результате которого Km = 50 нМ, Vmax = 0,98 нМ/с и Kcat = 9,31 с-1. Применение этого метода к анализу ингибитора урацилгликозилазы (UGI) дало значение IC50 7,6 пМ. Специфичность UDG с использованием урацила в различных положениях в одноцепочечных и двухцепочечных субстратах ДНК продемонстрировала различную эффективность расщепления. Таким образом, этот простой, быстрый и универсальный метод MALDI-TOF MS может стать отличным эталонным методом для различных монофункциональных гликозилаз ДНК. Он также имеет потенциал в качестве инструмента для скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.

Introduction

Хотя урацил является нормальным основанием в РНК, он является распространенным и высокомутагенным поражением в геномной ДНК. Урацил может возникать в результате спонтанного/ферментативного гидролитического дезаминирования дезоксицитидина. В каждой живой клетке это дезаминирование происходит 100-500 раз в сутки при физиологических условиях1,2. Если эти изменения не восстанавливаются, может произойти изменение в составе последовательности ДНК, вызывающее мутацию. Поскольку урацил в ДНК предпочитает спариваться с dATP во время репликации, если цитозин деаминтируется в урацил, в двух событиях репликации в половине ДНК потомства будет новая мутация перехода G:C в A:T.

Среди клеточных стратегий для поддержания генетической стабильности восстановление иссечения оснований (BER) является важным механизмом, который восстанавливает поврежденные основания, такие как урацил, в ДНК4. BER является высоко эволюционно сохраненным процессом. Существует два общих пути BER: короткий путь, ведущий к репарации одного нуклеотида, и путь длинного пятна, который производит репарационный тракт по крайней мере из двух нуклеотидов5. BER является скоординированным механизмом, который происходит в несколько этапов. Первым шагом в BER является ферментативный гидролиз поврежденного нуклеотидного основания повреждающей ДНК-гликозилазой для генерации промежуточного сайта апуринина/апиримидинового (AP)6. За этим следует расщепление сахарно-фосфатной основы в месте AP эндонуклеазой, очистка концов ДНК лиазой, заполнение промежутков ДНК-полимеразой и герметизация конечного ника лигазой5.

Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) гидролизует урацил из урацилсодержащей ДНК для BER в Escherichia coli. Обычные анализы UDG с использованием радиомаркированной ДНК с использованием различных методов разделения6,7,8,9,10,11,12,13 обычно являются трудоемкими, трудоемкими, с дорогостоящими реагентами маркировки, сложными процедурами и требуют интенсивной подготовки и практики для снижения рисков воздействия радиоактивных материалов. Фторометрические олигонуклеотидные анализы были разработаны в качестве замены для радиоизотопной маркировки14, в дополнение к молекулярным маякам и технологии резонансного переноса энергии Фёрстера15,16,17,18,19,20. Тем не менее, для всех вышеупомянутых методов требуется специальная маркировка. В последнее время были разработаны безметочные биосенсорные анализы21,22,23 и колориметрические методы, основанные на формировании G-квадруплекса24,25,26. Однако несколько пар A:U или специально разработанные последовательности в зондах усложняют определение ферментной единицы.

MALDI-TOF MS – это технология, которая может быть очень полезна в анализе ДНК. Разработанные приложения включают генотипирование однонуклеотидного полиморфизма27,28, модифицированный нуклеотидный анализ29 и промежуточную идентификацию репарации ДНК30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS должен быть легко принят для анализа ДНК-гликозилазы для обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP-сайт. Однако AP-сайты в ДНК склонны к разрыву нити при многих экспериментальных условиях33. Анализ UDG представлен здесь с использованием MALDI-TOF MS для непосредственного измерения производства на площадке AP без значительного шума разрыва пряди. Этот метод без меток прост в работе и имеет высокий потенциал для фармацевтического применения скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.

Protocol

1. Подготовка подложки/шаблона Конструкция урациловой подложки/шаблона дуплексная с сбалансированным содержанием G+C ~50 ± 10% и минимальной температурой плавления 50 °C для дуплексной области.ПРИМЕЧАНИЕ: Одна нуклеотидная разница между 18 нт субстратами и 19 нт шаблонами (<str…

Representative Results

Шаблоны и подложкиВзяв в качестве примера синтетические олигонуклеотиды с U в центре (U+9) в паре с шаблоном G (рис. 1А), для контроля качества чистоты синтетических олигонуклеотидов может быть использован пустой контроль эквимолярных количеств шаблона и урацил…

Discussion

В этой статье представлена подробная процедура использования метода анализа UDG MALDI-TOF MS для непосредственного обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что субстраты, содержащие урацил, не содержат этикеток, масштабируемы, просты в р?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Тайбэй, Тайвань) и NRPB Pharmacogenomics Lab (Тайбэй, Тайвань) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня, R.O.C. [номер гранта MOST109-2314-B-002 -186 для K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 для S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 для W.-h.F.]. H.-L.C. является получателем докторской стипендии от Национального университета Тайваня. Финансирование сбора за открытый доступ: Министерство науки и технологий, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochimie. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochimie. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochimie. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Keywords: Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
check_url/fr/63089?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image