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Biochimie

Ensayo de uracilo-ADN glicosilasa mediante desorción láser asistida por matriz/análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Se desarrolló un método no radioisotópico no marcado para evaluar la actividad de la uracilo-ADN glicosilasa utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF para el análisis directo de productos que contienen sitios apurínicos/apirimidínicos. El ensayo demostró ser bastante simple, específico, rápido y fácil de usar para la medición de la GLICosilasa de ADN.

Abstract

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) es un componente clave en la vía de reparación de la escisión de base para la corrección del uracilo formado por la desaminación hidrolítica de la citosina. Por lo tanto, es crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma. Se desarrolló un método altamente específico, no etiquetado, no radioisotópico para medir la actividad de UDG. Un dúplex de ADN sintético que contenía un uracilo específico del sitio fue escindido por UDG y luego sometido a un análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistido por láser / ionización asistido por matrix (MALDI-TOF MS). Se estableció un protocolo para preservar el producto del sitio apurínico/apirimidínico (AP) en el ADN sin rotura de hebra. El cambio en el valor m/z del sustrato al producto se utilizó para evaluar la hidrólisis de uracilo por UDG. Se utilizó un sustrato G:U para el análisis cinético UDG que arrojó el Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s y Kcat = 9.31 s-1. La aplicación de este método a un ensayo de inhibidor de la uraciloglicosasa (UGI) arrojó un valor de IC50 de 7,6 pM. La especificidad de UDG utilizando uracilo en varias posiciones dentro de sustratos de ADN de cadena simple y doble cadena demostró diferentes eficiencias de escisión. Por lo tanto, este método SIMPLE, rápido y versátil MALDI-TOF MS podría ser un excelente método de referencia para varias glucosilasas de ADN monofuncionales. También tiene el potencial como una herramienta para la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.

Introduction

Aunque el uracilo es una base normal en el ARN, es una lesión común y altamente mutagénica en el ADN genómico. El uracilo puede surgir de la desaminación hidrolítica espontánea/enzimática de una desoxicitidina. En cada célula viva, esta desaminación ocurre 100-500 veces al día en condiciones fisiológicas1,2. Si estas alteraciones no se reparan, puede haber un cambio en la composición de la secuencia de ADN, causando mutación. Como el uracilo en el ADN prefiere emparejarse con dATP durante la replicación, si la citosina se desamina a uracilo, en dos eventos de replicación, habrá una nueva mutación de transición de G:C a A:T en la mitad de la progenie DNA3.

Entre las estrategias celulares para mantener la estabilidad genética, la reparación por escisión de bases (BER) es un mecanismo esencial que repara las bases dañadas, como el uracilo, en el ADN4. BER es un proceso altamente conservado evolutivamente. Existen dos vías generales de BER: la vía de parche corto que conduce a un tracto de reparación de un solo nucleótido y la vía de parche largo que produce un tracto de reparación de al menos dos nucleótidos5. BER es un mecanismo coordinado que se produce en varios pasos. El primer paso en BER es la hidrólisis enzimática de la base de nucleótidos dañada por una GLICosilasa de ADN específica del daño para generar un sitio intermedio apurínico/apirimidínico (AP)6. Esto es seguido por la escisión de la columna vertebral de azúcar-fosfato en el sitio AP por una endonucleasa, la limpieza de los extremos del ADN por una liasa, el llenado de huecos por una ADN polimerasa y el sellado del corte final por una ligasa5.

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) hidroliza el uracilo del ADN que contiene uracilo para BER en Escherichia coli. Los ensayos convencionales de UDG que utilizan ADN radiomarcado que involucran diferentes técnicas de separación6,7,8,9,10,11,12,13 suelen requerir mucho tiempo, mano de obra, con costosos reactivos de etiquetado, procedimientos complicados y que requieren capacitación y práctica intensivas para reducir los riesgos de exposición a materiales radiactivos. Se han desarrollado ensayos fluorométricos de oligonucleótidos como sustituto del etiquetado de radioisótopos14, además de balizas moleculares y tecnología de transferencia de energía de resonancia de Förster15,16,17,18,19,20. Sin embargo, se requiere un etiquetado específico para todos los métodos antes mencionados. Recientemente se han desarrollado ensayos de biosensores libres de etiquetas21,22,23 y métodos colorimétricos basados en la formación de un G-quadruplex24,25,26. Sin embargo, múltiples pares A:U o secuencias especialmente diseñadas en las sondas complican la definición de la unidad enzimática.

MALDI-TOF MS es una tecnología que podría ser de gran utilidad en el análisis de ADN. Las aplicaciones desarrolladas incluyen el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido27,28, el análisis de nucleótidos modificados29 y la identificación intermedia de reparación de ADN30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS debe adoptarse fácilmente para el análisis de glicosilasa de ADN para detectar productos de ADN que contienen sitios AP. Sin embargo, los sitios AP en el ADN son propensos a la rotura de hebras bajo muchas condiciones experimentales33. Aquí se presenta un ensayo UDG utilizando MALDI-TOF MS para medir directamente la producción del sitio AP sin un ruido significativo de rotura de hebras. Este método sin etiqueta es fácil de trabajar y tiene un alto potencial para la aplicación farmacéutica de la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.

Protocol

1. Preparación de sustrato/plantilla Diseñe sustrato de uracilo / dúplex de plantilla con un contenido equilibrado de G + C de ~ 50 ± 10% y una temperatura de fusión mínima de 50 ° C para la región dúplex.NOTA: Una diferencia de nucleótidos entre sustratos de 18 nt y plantillas de 19 nt (Tabla 1 y Figura 1) ayuda a una mejor interpretación de la señal de EM y al recocido apropiado. La hebra de plantilla sirve como ADN complementario…

Representative Results

Plantillas y sustratosTomando como ejemplo los oligonucleótidos sintéticos con U en el centro (U+9) emparejados con una plantilla G (Figura 1A), se puede utilizar un control en blanco de las cantidades equimolares de plantilla y sustrato que contiene uracilo para el control de calidad de la pureza de los oligonucleótidos sintéticos (Figura 1B; las señales coinciden con el m/z designado y el bajo ruido de fondo). Para el análisis de los…

Discussion

Este documento proporciona un procedimiento detallado para el uso de un método de ensayo UDG MALDI-TOF MS para detectar directamente productos de ADN que contienen AP. Las principales ventajas de este método son que los sustratos que contienen uracilo no contienen etiquetas, son escalables, fáciles de trabajar y ofrecen una mayor flexibilidad en el diseño del sustrato.

La extracción de fenol/cloroformo recomendada por el proveedor de UDG permite la inactivación de la enzima para evitar l…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwán) y al Laboratorio de Farmacogenómica del NRPB (Taipei, Taiwán) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán, R.O.C. [número de subvención MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha recibido una beca de doctorado de la Universidad Nacional de Taiwán. Financiación para la tasa de acceso abierto: Ministerio de Ciencia y Tecnología, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
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References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochimie. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochimie. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochimie. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

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Keywords: Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
check_url/fr/63089?article_type=t

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Citer Cet Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
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