सिलिया बीट आवृत्ति के परिमाणीकरण के लिए प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिका मॉडल का संग्रह, विस्तार और भेदभाव
Summary
यह प्रोटोकॉल नाक उपकला कोशिका संग्रह, विस्तार और ऑर्गेनोटाइपिक वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल में भेदभाव और लाइव-सेल इमेजिंग और कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट के माध्यम से सिलिया बीट आवृत्ति का परिमाणीकरण का वर्णन करता है।
Abstract
सिलिया फ़ंक्शन (बीट फ्रीक्वेंसी, पैटर्न) के माप को प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया जैसे श्वसन रोगों के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है। हालांकि, इन तकनीकों का व्यापक अनुप्रयोग पर्यावरणीय कारकों जैसे तापमान, आर्द्रता और पीएच में परिवर्तन के लिए सिलिअरी फ़ंक्शन की अत्यधिक संवेदनशीलता से सीमित है। सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) वाले रोगियों के वायुमार्ग में, बलगम संचय सिलिया पिटाई में बाधा डालता है। सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) चैनल गतिविधि के संकेतक के रूप में प्राथमिक वायुमार्ग सेल मॉडल में सिलिया फ़ंक्शन की जांच की गई है। हालांकि, सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सिलिया बीटिंग आवृत्ति में काफी रोगी-से-रोगी परिवर्तनशीलता पाई गई है, यहां तक कि समान सीएफटीआर उत्परिवर्तन वाले रोगियों के लिए भी। इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन पर निष्क्रिय सीएफटीआर-विनियमित क्लोराइड स्राव का प्रभाव खराब समझा जाता है। वर्तमान में इन विट्रो वायुमार्ग मॉडल, छवि अधिग्रहण और सिलिया बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) के विश्लेषण की नमूना तैयारी का प्रदर्शन करने वाला कोई व्यापक प्रोटोकॉल नहीं है। पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित स्थिति में किए गए मानकीकृत संस्कृति की स्थिति और छवि अधिग्रहण व्यक्तियों के बीच सीबीएफ के सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिमाणीकरण और सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सक्षम करेगा। यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल प्रणालियों में सीबीएफ की मात्रा का वर्णन करता है: 1) देशी उपकला शीट, 2) पारगम्य समर्थन सम्मिलित पर चित्रित वायु-तरल इंटरफ़ेस मॉडल, और 3) बाह्य मैट्रिक्स-एम्बेडेड तीन-आयामी ऑर्गेनोइड। बाद के दो विवो फेफड़ों के शरीर विज्ञान में प्रतिकृति करते हैं, जिसमें सिलिया को हरा दिया जाता है और बलगम का उत्पादन होता है। सिलियरी फ़ंक्शन को पर्यावरण-नियंत्रित कक्ष में एक उच्च गति वाले वीडियो कैमरे का उपयोग करके कैप्चर किया गया है। सीबीएफ के विश्लेषण के लिए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है। क्लिनिक में सीबीएफ माप का अनुवाद प्रति-रोगी आधार पर सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण होने की कल्पना की गई है।
Introduction
सिलिया बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) और पैटर्न के माप को प्राथमिक सिलियरी डिस्केनेसिया (पीसीडी) 1 जैसे श्वसन रोगों के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है। सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) में, सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) क्लोराइड चैनल की शिथिलता वायुमार्ग की सतह तरल के निर्जलीकरण और बिगड़ा हुआ म्यूकोसिलरी निकासीका कारण बनती है। प्राथमिक वायुमार्ग सेल मॉडल में सिलियरी फ़ंक्शन की जांच सीएफटीआर चैनल गतिविधि 3 के संकेतक के रूप में की गईहै। हालांकि, सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सीबीएफ में काफी रोगी-से-रोगी परिवर्तनशीलता मौजूद है, यहां तक कि एक ही सीएफटीआर उत्परिवर्तनवाले रोगियों के लिए भी। इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन पर निष्क्रिय सीएफटीआर-विनियमित क्लोराइड स्राव का प्रभाव खराब समझा जाता है। वर्तमान में इन विट्रो वायुमार्ग मॉडल, छवि अधिग्रहण और सीबीएफ के विश्लेषण की नमूना तैयारी का प्रदर्शन करने वाला कोई व्यापक प्रोटोकॉल नहीं है।
नाक के म्यूकोसल ब्रशिंग से अलग नाक उपकला शीट का उपयोग सीधे पीसीडी निदान के लिए सिलियरी फ़ंक्शन के माप के लिए किया जाताहै। फिर भी, जबकि प्राप्त नाक उपकला शीट के आकार या गुणवत्ता पर कोई नियंत्रण नहीं है, सीबीएफ इस बात पर निर्भर करता है कि क्या इसे एकल कोशिकाओं या सेल शीट पर मापा जाता है और उपकला शीट सिलिएटेड किनारों पर जो बाधित या अबाधितहोते हैं। जैसे, नाक म्यूकोसल ब्रशिंग के संग्रह के दौरान कोशिकाओं को नुकसान के कारण द्वितीयक डिस्केनेसिया सीबीएफ को प्रभावित कर सकता है। नाक उपकला कोशिकाओं की प्राथमिक कोशिका संस्कृति और एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) या तीन आयामी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सिलिएटेड वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स में उनका भेदभाव सिलिया को जन्म देता है जो द्वितीयक डिस्केनेसिया 4,6,7,8 से मुक्त होते हैं। एएलआई (अब से एएलआई मॉडल कहा जाता है) में विभेदित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण माध्यमिक नैदानिक सहायता माना गया है जो सिलियरी बीट पैटर्न और एक्स विवो नाक म्यूकोसल ब्रशिंग6 की आवृत्ति को दोहराता है और रोगी-विशिष्ट दोषों को बनाए रखते हुए सिलियरी अल्ट्रास्ट्रक्चर, बीट पैटर्न और बीट आवृत्ति के विश्लेषण को सक्षम करताहै। . फिर भी, इन स्यूडोस्ट्रेटिफाइड, म्यूकोसिलरी विभेदित सेल मॉडल बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों में विसंगतियां मौजूद हैं। विभिन्न संस्कृति विस्तार या भेदभाव प्रोटोकॉल अलग-अलग उपकला फेनोटाइप (सिलिएटेड या स्रावी) 10 को प्रेरित कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप सीबीएफ11 में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है। सीबीएफ को नाक के उपकला ब्रशिंग 4,6,12,13,14,15,16, वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स 14,17,18 और एएलआई मॉडल 3,4,6,13,19,20 में परिमाणित किया गया है। 21. फिर भी, इन प्रोटोकॉल के बीच, बड़ी विविधताएं हैं, और अक्सर कई मापदंडों को नियंत्रित नहीं किया जाता है। उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों में, सीबीएफ को सीटू में चित्रित किया जाता है, जबकि एएलआई मॉडल की कोशिकाएं पारगम्य समर्थन प्रविष्टि 3,19,20,21 पर रहती हैं, फिर भी अन्य पारगम्य समर्थन सम्मिलित से कोशिकाओं को खुरचते हैं और उन्हें मीडिया 4,6,13 में निलंबित करते हैं।
इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन को मापने वाली तकनीकों का व्यापक अनुप्रयोग पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन के लिए सिलियरी फ़ंक्शन की अत्यधिक संवेदनशीलता से सीमित है। तापमान 22, आर्द्रता23,24, और पीएच 25,26 जैसे पर्यावरणीय कारक सिलिअरी फ़ंक्शन को प्रभावित करते हैं और सीबीएफ को सटीक रूप से मापने के लिए विनियमित किया जाना चाहिए। विभिन्न प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न शारीरिक मापदंडों और वे सीबीएफ को कैसे प्रभावित करते हैं,की पहले समीक्षा की गई है।
सीबीएफ माप के लिए विभिन्न इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और दृष्टिकोणों को साहित्य में बताया गया है। पीसीडी निदान के लिए, वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग सिलियरी फ़ंक्शन28,29 को मापने के लिए किया जाता है। हाल ही में, वायुमार्ग उपकला सेल एएलआई मॉडल3,30 में सीबीएफ और सिलिया समन्वय दोनों को मापने के लिए अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक वीडियो विश्लेषण एल्गोरिदम का उपयोग किया गया था। यह विधि क्षेत्रों को विभाजित या चयनित करने की आवश्यकता के बिना, वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में सिलियरी बीटिंग के लक्षण वर्णन को तेज और पूरी तरह से स्वचालित तरीके से सक्षम बनाती है। सीबीएफ की इमेजिंग और परिमाणीकरण के लिए विभिन्न तरीके साहित्य में सीबीएफ में रिपोर्ट किए गए मतभेदों को जोड़ सकते हैं (पूरक फाइल 1)।
मौजूदा तरीकों को सुव्यवस्थित करने के लिए संस्कृति से परिमाणीकरण तक एक प्रोटोकॉल, संस्कृति की स्थितियों का मानकीकरण, और छवि अधिग्रहण, सख्त पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित परिस्थितियों में किया जाता है, व्यक्तियों के भीतर और बीच सीबीएफ के सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिमाणीकरण को सक्षम करेगा।
यह प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं के संग्रह, विस्तार और भेदभाव संस्कृति की स्थिति, और नाक मूल के तीन अलग-अलग वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल प्रणालियों में सीबीएफ की मात्रा का पूरा विवरण प्रदान करता है: 1) देशी उपकला शीट, 2) पारगम्य समर्थन आवेषण पर चित्रित एएलआई मॉडल और 3) एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) -एम्बेडेड तीन-आयामी ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 1) ). नाक के अवर टर्बिनेट ब्रशिंग से प्राप्त नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग वायुमार्ग उपकला के प्रतिनिधियों के रूप में किया जाता है क्योंकि वे ब्रोन्कियल ब्रशिंग एकत्र करने से जुड़ी आक्रामक प्रक्रिया पर काबू पाने के दौरान ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओंके लिए एक प्रभावी सरोगेट हैं। सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल (सीआरसी) विधि का उपयोग एएलआई मॉडल और त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड्स के निर्माण के लिए प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए किया जाता है। स्टेम सेल जैसी स्थिति में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की सशर्त पुन: प्रोग्रामिंग विकास-गिरफ्तार फाइब्रोब्लास्ट फीडर सेल सिस्टम और आरएचओ-संबद्ध किनेज (रॉक) अवरोधक32 के साथ सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित होती है। महत्वपूर्ण रूप से, सीआरसी विधि वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में आबादी को दोगुना करती है, जबकि उनके ऊतक-विशिष्ट भेदभाव क्षमता33,34 को बनाए रखती है। सभी वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल में, सिलियरी फ़ंक्शन को मानकीकृत छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ उच्च गति वाले वीडियो कैमरे का उपयोग करके तापमान-नियंत्रित कक्ष में कैप्चर किया जाता है। सीबीएफ की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है।
चित्रा 1: वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। प्रतिभागियों के नाक के अवर टर्बिनेट को ब्रश करने के बाद, वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का उपयोग दो तरीकों में से एक में किया जाता है। या तो वायुमार्ग उपकला शीट को अलग किया जाता है, और सिलिया बीट आवृत्ति को तुरंत चित्रित किया जाता है, या वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल विधि के माध्यम से विस्तारित किया जाता है। सीआरसी-विस्तारित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को वायु-तरल इंटरफ़ेस या वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए विभेदित किया जाता है। सिलियरी बीट आवृत्ति की इमेजिंग को हीटिंग और आर्द्रता पर्यावरण कक्ष और एक तेज फ्रेम दर (>100 हर्ट्ज) वैज्ञानिक कैमरे के साथ लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। डेटा विश्लेषण कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग करके किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे कई कारक हैं जो नाक उपकला शीट में सीबीएफ की मात्रा का निर्धारण अस्पष्ट कर सकते हैं। एपिथेलियल शीट्स को नमूना संग्रह के 3-9 घंटों के भीतर चित्रित किया जाना चाहिए क्योंकि इस समयके दौरान सिलियर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अध्ययन प्रतिभागियों और उनके परिवारों को उनके योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। हम संगठन और रोगी जैव नमूनों के संग्रह में सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल्स (एससीएच) रैंडविक श्वसन विभाग से सहायता की सराहना करते हैं – डॉ जॉन विडर, डॉ यवोन बेलेसिस, लीन प्लस, अमांडा थॉम्पसन और रोंडा बेल के लिए विशेष धन्यवाद। हम यूएनएसडब्ल्यू सिडनी में मार्क वेनराइट एनालिटिकल सेंटर के भीतर कैथरीना गॉस लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा से इवेता स्लैपेटोवा और रेनी व्हान की सहायता को स्वीकार करते हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) ऑस्ट्रेलिया (जीएनटी 1188987), सीएफ फाउंडेशन ऑस्ट्रेलिया और सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। लेखक अपने योगदान और समर्थन के लिए ल्यूमिनेस एलायंस – बच्चों के स्वास्थ्य के लिए नवाचार को स्वीकार करना चाहते हैं। ल्यूमिनेस एलायंस – बच्चों के स्वास्थ्य के लिए नवाचार सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल्स नेटवर्क, चिल्ड्रन मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट और चिल्ड्रन कैंसर इंस्टीट्यूट के बीच एक गैर-लाभकारी सहकारी संयुक्त उद्यम है। यह बाल चिकित्सा अनुसंधान के समन्वय और एकीकृत करने के लिए एनएसडब्ल्यू सरकार के समर्थन से स्थापित किया गया है। लुमिनेसे एलायंस सिडनी विश्वविद्यालय और न्यू साउथ वेल्स सिडनी विश्वविद्यालय से भी संबद्ध है। केएमए एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। एलकेएफ को रोटरी क्लब ऑफ सिडनी कोव / सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन और यूएनएसडब्ल्यू यूनिवर्सिटी स्नातकोत्तर पुरस्कार छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
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