Coleta, Expansão e Diferenciação de Modelos Primários de Células Epiteliais Nasais Humanas para Quantificação da Frequência de Batimento de Cílios

Summary

Este protocolo descreve a coleta, expansão e diferenciação de células epiteliais nasais para modelos de células epiteliais organotípicas das vias aéreas e quantificação da frequência de batimentos de cílios por meio de imagens de células vivas e scripts personalizados.

Abstract

Medidas da função dos cílios (frequência de batimento, padrão) foram estabelecidas como ferramentas diagnósticas para doenças respiratórias, como discinesia ciliar primária. No entanto, a aplicação mais ampla dessas técnicas é limitada pela extrema suscetibilidade da função ciliar a mudanças em fatores ambientais, por exemplo, temperatura, umidade e pH. Nas vias aéreas de pacientes com Fibrose Cística (FC), o acúmulo de muco impede o batimento dos cílios. A função dos cílios tem sido investigada em modelos celulares primários das vias aéreas como um indicador da atividade do canal CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). No entanto, uma considerável variabilidade de paciente para paciente na frequência de batimento de cílios foi encontrada em resposta a drogas moduladoras de CFTR, mesmo para pacientes com as mesmas mutações de CFTR . Além disso, o impacto da secreção disfuncional de cloreto regulado por CFTR na função ciliar é pouco compreendido. Atualmente, não existe um protocolo abrangente que demonstre a preparação de amostras de modelos de vias aéreas in vitro , a aquisição de imagens e a análise da frequência de batimento ciliar (CBF). Condições de cultura padronizadas e aquisição de imagens realizadas em uma condição ambientalmente controlada permitiriam quantificação consistente e reprodutível do FSC entre indivíduos e em resposta a drogas moduladoras de CFTR. Este protocolo descreve a quantificação do CBF em três diferentes sistemas de modelos de células epiteliais das vias aéreas: 1) folhas epiteliais nativas, 2) modelos de interface ar-líquido fotografados em pastilhas de suporte permeáveis e 3) organoides tridimensionais embutidos em matriz extracelular. Os dois últimos replicam a fisiologia pulmonar de vivo, com batimento de cílios e produção de muco. A função ciliar é capturada usando uma câmera de vídeo de alta velocidade em uma câmara controlada pelo ambiente. Scripts personalizados são usados para a análise do CBF. A tradução das medidas do CBF para a clínica é considerada uma importante ferramenta clínica para prever a resposta a medicamentos moduladores de CFTR por paciente.

Introduction

Medidas de frequência e padrão de batimento ciliar (CBF) têm sido estabelecidas como ferramentas diagnósticas para doenças respiratórias, como a discinesia ciliar primária (PCD)¹. Na Fibrose Cística (FC), a disfunção do canal de cloreto do Regulador de Condutância Transmembrana Transmembrana da FC (CFTR) causa desidratação do líquido superficial das vias aéreas e comprometimento do clearance mucociliar². A função ciliar tem sido investigada in vitro em modelos primários de células das vias aéreas como um indicador da atividade do canal CFTR³. No entanto, existe uma considerável variabilidade paciente-a-paciente no FSC em resposta a drogas moduladoras de CFTR, mesmo para pacientes com as mesmas mutações do CFTR ³. Além disso, o impacto da secreção disfuncional de cloreto regulado por CFTR na função ciliar é pouco compreendido. Atualmente, não há um protocolo abrangente que demonstre a preparação de amostras de modelos de vias aéreas in vitro , aquisição de imagens e análise de CBF.

Folhas epiteliais nasais isoladas de escovações da mucosa nasal são diretamente utilizadas para medidas da função ciliar para o diagnóstico de PCD⁴. No entanto, embora não haja controle sobre o tamanho ou a qualidade das folhas epiteliais nasais obtidas, o FSC varia dependendo se é medido em células únicas ou folhas celulares e em bordas ciliadas de folha epitelial que são interrompidas ou ininterruptas⁵. Dessa forma, discinesias secundárias causadas por danos às células durante a coleta de escovações da mucosa nasal podem influenciar o FSC. A cultura celular primária de células epiteliais nasais e sua diferenciação na Interface Ar-Líquido (LPA) ou na matriz tridimensional da membrana basal em organoides epiteliais das vias aéreas ciliadas dão origem a cílios livres de discinesias secundárias 4,6,7,8. As células epiteliais das vias aéreas diferenciadas na LPA (doravante denominadas modelos de LPA) têm sido consideradas um importante auxiliar diagnóstico secundário que replica os padrões de batimentos ciliares e a frequência de escovações ex vivo da mucosa nasal⁶ e permite a análise da ultraestrutura ciliar, padrão de batimento e frequência de batimentos, mantendo defeitos específicos do paciente⁹ . No entanto, existem discrepâncias nas metodologias usadas para criar esses modelos de células pseudoestratificadas e mucociliares diferenciadas. Diferentes protocolos de expansão ou diferenciação da cultura podem induzir fenótipos epiteliais distintos (ciliados ou secretores)¹⁰ e resultar em diferenças significativas no CBF¹¹. O CBF foi quantificado em escovações epiteliais nasais 4,6,12,13,14,15,16, organoides epiteliais das vias aéreas 14,17,18 e modelos LPA 3,4,6,13,19,20^{, 21}. No entanto, entre esses protocolos, existem grandes variabilidades e, muitas vezes, muitos parâmetros não são controlados. Por exemplo, em alguns estudos, o CBF é fotografado in situ enquanto as células do modelo LPA permanecem na inserção de suporte permeável 3,19,20,21, outras ainda raspam as células da inserção de suporte permeável e as fotografam suspensas em meio 4,6,13.

Além disso, a aplicação mais ampla de técnicas que medem a função ciliar é limitada pela extrema suscetibilidade da função ciliar a mudanças em fatores ambientais. Fatores ambientais como temperatura²², umidade 23,24 e pH^25,26 influenciam a função ciliar e devem ser regulados para quantificar o FSC com precisão. Os diversos parâmetros fisiológicos utilizados em diferentes laboratórios e como eles influenciam o FSC já foram revisados anteriormente²⁷.

Várias tecnologias de imagem e abordagens para medidas de CBF são relatadas na literatura. Para o diagnóstico de PCD, a videomicroscopia é utilizada para medir a função ciliar^28,29. Recentemente, um algoritmo de videoanálise baseado em microscopia dinâmica diferencial foi utilizado para quantificar a coordenação do FSC e dos cílios em modelos de LPA de células epiteliais das vias aéreas ^3,30. Este método permite a caracterização do batimento ciliar em células epiteliais das vias aéreas de forma rápida e totalmente automatizada, sem a necessidade de segmentar ou selecionar regiões. Vários métodos de imagem e quantificação do FSC podem se somar às diferenças relatadas no FSC na literatura (Arquivo Suplementar 1).

Um protocolo da cultura à quantificação para agilizar os métodos existentes, a padronização das condições de cultura e a aquisição de imagens, realizadas em condições rigorosas e ambientalmente controladas, permitiriam a quantificação consistente e reprodutível do CBF dentro e entre os indivíduos.

Este protocolo fornece uma descrição completa da coleção de células epiteliais, condições de cultura de expansão e diferenciação e quantificação do FSC em três diferentes sistemas de modelo de células epiteliais das vias aéreas de origem nasal: 1) folhas epiteliais nativas, 2) modelos de LPA fotografados em pastilhas de suporte permeável e 3) organoides tridimensionais embutidos na Matriz Extracelular (ECM) (Figura 1 ). As células epiteliais nasais obtidas a partir de escovações nasais de cornetos inferiores são utilizadas como representantes do epitélio das vias aéreas, uma vez que são um substituto eficaz para as células epiteliais brônquicas³¹, superando o procedimento invasivo associado à coleta de escovações brônquicas. O método Conditional Reprogramming Cell (CRC) é usado para expandir células epiteliais primárias das vias aéreas para a criação de modelos de LPA e organoides tridimensionais. A reprogramação condicional de células epiteliais das vias aéreas para um estado semelhante a células-tronco é induzida pela cocultura com o sistema de células alimentadoras de fibroblastos preso ao crescimento e inibidor da quinase associada a Rho (ROCK)³². É importante ressaltar que o método do CCR aumenta a duplicação populacional das células epiteliais das vias aéreas, mantendo seu potencial de diferenciação tecidual específico^33,34. Em todos os modelos de células epiteliais das vias aéreas, a função ciliar é capturada em uma câmara de temperatura controlada usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com configurações padronizadas de aquisição de imagem. Scripts personalizados são empregados para a quantificação do CBF.

Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho. Após a escovação do corneto nasal inferior dos participantes, as células epiteliais das vias aéreas são utilizadas de duas maneiras. Ou as folhas epiteliais das vias aéreas são isoladas e a frequência de batimento dos cílios é visualizada imediatamente, ou as células epiteliais das vias aéreas são expandidas através do método de células de reprogramação condicional. As células epiteliais das vias aéreas expandidas por CCR são diferenciadas para estabelecer células epiteliais das vias aéreas em uma interface ar-líquido ou culturas organoides epiteliais das vias aéreas. A imagem da frequência de batimentos ciliares é adquirida usando um microscópio de imagem de células vivas com uma câmara ambiental de aquecimento e umidade e uma câmera científica de taxa de quadros rápida (>100Hz). A análise de dados é realizada usando scripts personalizados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

A aprovação do estudo foi recebida do Conselho de Revisão de Ética da Rede de Hospitais Infantis de Sydney (HREC/16/SCHN/120). O consentimento por escrito foi obtido de todos os participantes (ou responsável dos participantes) antes da coleta dos bioespécimes. 1. Preparações para o estabelecimento de modelos de células epiteliais das vias aéreas Preparar meios de coleta de células nasais combinando 80% de Meio de Águia Modificado de Dulbecco e 20% de Soro…

Representative Results

Para demonstrar a eficiência deste protocolo na quantificação do FSC, são apresentados os resultados do FSC medido em modelos de LPA de células epiteliais das vias aéreas derivados de três participantes com FC e três participantes controles saudáveis. No 14º dia de diferenciação cultural, os cílios batedores estavam presentes (Figura 6). Do 14º ao 21º dia de diferenciação cultural, observou-se um aumento estatisticamente significativo (P < 0,0345) no FSC em ambas as coortes….

Discussion

Existem múltiplos fatores que podem obscurecer a quantificação do FSC nas folhas epiteliais nasais. As folhas epiteliais devem ser fotografadas dentro de 3-9 horas após a coleta da amostra, uma vez que a função ciliar é mais estável durante esse período³⁷. Menos glóbulos vermelhos e detritos são mais ideais para imagens, uma vez que interferem na aquisição de dados. Ao selecionar um ROI para exames de imagem, é importante selecionar uma folha epitelial que não tenha sido danificada …

Materials

Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	10 mg/mL
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Alanyl-glutamine	Sigma-Aldrich	G8541	200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOS	Oxford Instruments		Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Ceftazidime hydrate	Sigma-Aldrich	A6987	50 mg/mL
Cell Culture Microscope	Olympus	CKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC	Nikon Instruments Inc.	MRH08230	Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052-1MG	200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UM	Sigma-Aldrich	CLS431750	Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)	Corning	356231	Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container	Sigma-Aldrich	CLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts	Sigma-Aldrich	CLS3470	Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Cytology brushes	McFarlane Medical	33009
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM-High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Eclipse Ti2-E	Nikon		Live-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Thermo Fisher Scientific	10082147
Fungizone (Amphotericin B)	Thermo Fisher Scientific	15290018	250 µg/mL
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL
Graphpad Prism	Graphpad		Scientific analysis software
Greiner Cryo.s vials	Sigma-Aldrich	V3135	Cryogenic vials
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M
HI-FBS	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	3.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000	PeCon		Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643	2 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L	John Morris Group	74220 706	Bead bath
Lab Armor Beads	Thermo Fisher Scientific	A1254302	Thermal beads
MATLAB	MathWorks		Computing software
Microsoft Excel	Microscoft		Spreadsheet software
NIH/3T3	American Type Culture Collection	CRL-1658	Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements AR	Nikon Instruments Inc.		Image acquisition software
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
PneumaCult Airway Organoid Kit	StemCell Technologies	5060	Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI Medium	StemCell Technologies	5001
PneumaCult-Ex Plus Medium	StemCell Technologies	5040
PureCol-S	Advanced BioMatrix	5015	Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)	Sigma-Aldrich	E9644	25 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)	Selleckchem	S1049	10 mM
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014	100 mg/mL
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
UNO Stage Top Incubator	Okolab		Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning