Denne protokol beskriver nasal epitelcelleindsamling, ekspansion og differentiering til organotypiske luftvejsepitelcellemodeller og kvantificering af cilia-beatfrekvens via levende cellebilleddannelse og specialbyggede scripts.
Målinger af ciliafunktion (slagfrekvens, mønster) er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom primær ciliær dyskinesi. Den bredere anvendelse af disse teknikker er imidlertid begrænset af den ekstreme modtagelighed af ciliær funktion for ændringer i miljøfaktorer, f.eks. temperatur, fugtighed og pH. I luftvejene hos patienter med cystisk fibrose (CF) forhindrer slimophobning ciliaslag. Cilian-funktion er blevet undersøgt i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) kanalaktivitet. Imidlertid er der fundet betydelig patient-til-patient-variation i cilia-slagfrekvens som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer . Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der er i øjeblikket ingen omfattende protokol, der demonstrerer prøveforberedelse af in vitro luftvejsmodeller, billedoptagelse og analyse af Cilia Beat Frequency (CBF). Standardiserede kulturforhold og billedoptagelse udført i en miljøkontrolleret tilstand ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF mellem individer og som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler. Denne protokol beskriver kvantificeringen af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer: 1) native epitelark, 2) luft-væske-grænseflademodeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) ekstracellulære matrixindlejrede tredimensionelle organoider. De to sidstnævnte replikerer in vivo lungefysiologi, med slå cilia og produktion af slim. Ciliary-funktionen optages ved hjælp af et højhastighedsvideokamera i et miljøstyret kammer. Specialbyggede scripts bruges til analyse af CBF. Oversættelse af CBF-målinger til klinikken er tænkt som et vigtigt klinisk værktøj til at forudsige respons på CFTR-modulerende lægemidler pr. patient.
Målinger af Cilia Beat Frequency (CBF) og mønster er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom Primary Ciliary Dyskinesia (PCD)1. I cystisk fibrose (CF) forårsager dysfunktion af CF Transmembrane konduktansregulatoren (CFTR) chloridkanal dehydrering af luftvejsoverfladevæsken og nedsat mucociliær clearance2. Ciliaryfunktion er blevet undersøgt in vitro i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CFTR-kanalaktivitet3. Der er imidlertid betydelig variation mellem patienter i CBF som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer 3. Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der findes i øjeblikket ingen omfattende protokol, der viser prøveforberedelse af in vitro-luftvejsmodeller , billedoptagelse og analyse af CBF.
Næseepitelplader isoleret fra næseslimhindebørstninger anvendes direkte til målinger af ciliær funktion til PCD-diagnose4. Men selvom der ikke er nogen kontrol over størrelsen eller kvaliteten af de opnåede næseepitelark, varierer CBF afhængigt af, om det måles på enkeltceller eller celleark og på epitelark cilierede kanter, der er forstyrret eller uforstyrret5. Som sådan kan sekundære dyskinesier forårsaget af skader på celler under indsamling af næseslimhindebørstninger påvirke CBF. Primær cellekultur af nasale epitelceller og deres differentiering ved Air-Liquid Interface (ALI) eller i tredimensionel kældermembranmatrix i cilierede luftvejsepitelorganoider giver anledning til cilier, der er fri for sekundære dyskinesier 4,6,7,8. Luftvejsepitelceller differentieret ved ALI (fremover kaldet ALI-modeller) er blevet betragtet som et vigtigt sekundært diagnostisk hjælpemiddel, der replikerer ciliary beat-mønstre og hyppighed af ex vivo nasal slimhindebørstning6 og muliggør analyse af ciliær ultrastruktur, taktmønster og slagfrekvens, samtidig med at patientspecifikke defekter bevares9 . Alligevel findes der uoverensstemmelser i de metoder, der bruges til at skabe disse pseudostratificerede, mucociliære differentierede cellemodeller. Forskellige kulturudvidelses- eller differentieringsprotokoller kan inducere forskellige epitelfænotyper (cilierede eller sekretoriske)10 og resultere i signifikante forskelle i CBF11. CBF er blevet kvantificeret i næseepitelbørster 4,6,12,13,14,15,16, luftvejsepitelorganoider 14,17,18 og ALI modeller 3,4,6,13,19,20, 21. Men blandt disse protokoller er der store variationer, og ofte er der mange parametre, der ikke kontrolleres for. For eksempel er CBF i nogle undersøgelser afbildet in situ, mens cellerne i ALI-modellen forbliver på den permeable støtteindsats 3,19,20,21, mens andre skraber cellerne fra den permeable støtteindsats og afbilder dem suspenderet i medier 4,6,13.
Desuden er den bredere anvendelse af teknikker, der måler ciliær funktion, begrænset af ciliaryfunktionens ekstreme modtagelighed for ændringer i miljøfaktorer. Miljøfaktorer som temperatur22, fugtighed 23,24 og pH 25,26 påvirker ciliaryfunktionen og skal reguleres for at kvantificere CBF nøjagtigt. De forskellige fysiologiske parametre, der anvendes på tværs af forskellige laboratorier, og hvordan de påvirker CBF, er blevet gennemgået tidligere27.
Forskellige billeddannelsesteknologier og tilgange til CBF-målinger er rapporteret i litteraturen. Til PCD-diagnostik bruges videomikroskopi til at måle ciliær funktion28,29. For nylig blev en videoanalysealgoritme baseret på differentiel dynamisk mikroskopi brugt til at kvantificere både CBF- og cilia-koordinering i luftvejsepitelcelle ALI-modeller 3,30. Denne metode muliggør karakterisering af ciliary beating i luftvejsepitelceller på en hurtig og fuldautomatisk måde uden behov for at segmentere eller vælge regioner. Forskellige metoder til billeddannelse og kvantificering af CBF kan øge de forskelle, der er rapporteret i CBF i litteraturen (supplerende fil 1).
En protokol fra kultur til kvantificering for at strømline eksisterende metoder, standardisering af kulturforhold og billedoptagelse, udført under strenge miljøkontrollerede forhold, ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF inden for og mellem individer.
Denne protokol giver en komplet beskrivelse af samlingen af epitelceller, ekspansions- og differentieringskulturbetingelser og kvantificering af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer af nasal oprindelse: 1) native epitelark, 2) ALI-modeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) Extracellular Matrix (ECM) -indlejrede tredimensionelle organoider (figur 1 ). Nasale epitelceller opnået fra nasal inferior turbinat børstninger anvendes som repræsentanter for luftvejsepitellet, da de er en effektiv surrogat for bronchiale epitelceller31, mens de overvinder den invasive procedure forbundet med indsamling af bronchiale børstninger. CRC-metoden (Conditional Reprogramming Cell) bruges til at udvide primære luftvejsepitelceller til oprettelse af ALI-modeller og tredimensionelle organoider. Betinget omprogrammering af luftvejsepitelceller til en stamcellelignende tilstand induceres ved samkultur med væksthæmmet fibroblastfødecellesystem og Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer32. Det er vigtigt, at CRC-metoden øger populationsfordoblingen i luftvejsepitelceller, samtidig med at deres vævsspecifikke differentieringspotentiale bevares33,34. I alle luftvejsepitelcellemodeller fanges ciliaryfunktionen i et temperaturstyret kammer ved hjælp af et højhastighedsvideokamera med standardiserede billedoptagelsesindstillinger. Specialbyggede scripts anvendes til kvantificering af CBF.
Figur 1: Skematisk for arbejdsgang. Efter børstning af deltagernes nasale ringere turbinat, anvendes luftvejsepitelceller på en af to måder. Enten isoleres luftvejsepitelark, og cilia-beatfrekvensen afbildes straks, eller luftvejsepitelceller udvides via den betingede omprogrammeringscellemetode. CRC-ekspanderede luftvejsepitelceller differentieres for at etablere luftvejsepitelceller ved en luft-væske-grænseflade eller luftvejsepitelorganoidkulturer. Billeddannelse af ciliary beatfrekvens erhverves ved hjælp af et levende cellebilledmikroskop med et opvarmnings- og fugtighedsmiljøkammer og et videnskabeligt kamera med hurtig billedhastighed (>100Hz). Dataanalyse udføres ved hjælp af specialbyggede scripts. Klik her for at se en større version af denne figur.
Der er flere faktorer, der kan skjule kvantificeringen af CBF i næseepitelark. Epitelark skal afbildes inden for 3-9 timer efter prøveindsamling, da ciliaryfunktionen er mest stabil i løbet af denne tid37. Mindre røde blodlegemer og snavs er mest optimale til billeddannelse, da disse forstyrrer dataindsamlingen. Når du vælger et investeringsafkast til billeddannelse, er det vigtigt at vælge et epitelark, der ikke er blevet beskadiget eller forstyrret under indsamlingen af prøven, og ikke e…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker undersøgelsesdeltagerne og deres familier for deres bidrag. Vi sætter pris på hjælpen fra Sydney Children’s Hospitals (SCH) Randwick respiratoriske afdeling i organisationen og indsamlingen af patientbiospecimens – særlig tak til Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson og Rhonda Bell. Vi anerkender hjælpen fra Iveta Slapetova og Renee Whan fra Katharina Gaus Light Microscopy Facility inden for Mark Wainwright Analytical Center ved UNSW Sydney. Dette arbejde støttes af National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia og Sydney Children’s Hospital Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende Luminesce Alliance – Innovation for Children’s Health for dets bidrag og støtte. Luminesce Alliance – Innovation for Children’s Health er et non-profit kooperativt joint venture mellem Sydney Children’s Hospitals Network, Children’s Medical Research Institute og Children’s Cancer Institute. Det er blevet oprettet med støtte fra NSW-regeringen for at koordinere og integrere pædiatrisk forskning. Luminesce Alliance er også tilknyttet University of Sydney og University of New South Wales Sydney. KMA støttes af et australsk regerings forskningsuddannelsesprogramstipendium. LKF er støttet af Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children’s Hospital Foundation og UNSW University postgraduate award stipendier.
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
MATLAB | MathWorks | Computing software | |
Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |