Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La migration et l’invasion cellulaires sont des caractéristiques spécifiques des tumeurs mutantes H3K27M du gliome médian diffus (DMG). Nous avons déjà modélisé ces caractéristiques à l’aide de tests tridimensionnels (3D) d’invasion et de migration cellulaires. Dans cette étude, nous avons optimisé ces tests 3D pour l’immunocytochimie des cellules vivantes. Un réactif de marquage des anticorps a été utilisé pour détecter en temps réel l’expression de la molécule d’adhésion CD44, sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes d’une lignée cellulaire primaire dérivée du patient DMG H3K27M. CD44 est associé au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales et est impliqué dans les interactions directes avec la matrice extracellulaire du système nerveux central (SNC). Les neurosphères (NS) de la lignée cellulaire DMG H3K27M ont été intégrées dans la matrice de la membrane basale (BMM) ou placées sur une fine couche de revêtement de BMM, en présence d’un anticorps anti-CD44 en conjonction avec le réactif de marquage des anticorps (ALR). L’analyse d’images immunocytochimiques de cellules vivantes en 3D a été réalisée sur un instrument d’analyse de cellules vivantes pour mesurer quantitativement l’expression globale de CD44, en particulier sur les cellules migratrices et envahissantes. La méthode permet également de visualiser en temps réel l’expression intermittente de CD44 sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test a également fourni de nouvelles informations sur le rôle potentiel de CD44 dans la transition mésenchymateuse vers amiboïde dans les cellules DMG H3K27M.
Introduction
La capacité des cellules tumorales à s’échapper et à se disséminer à travers les tissus environnants est une caractéristique du cancer1. En particulier, la motilité des cellules tumorales est une caractéristique des tumeurs malignes, qu’il s’agisse d’un type de tumeur métastatique tel que le cancer du sein2 ou colorectal3 ou d’un type localement invasif tel que le gliome diffus 4,5.
L’imagerie joue un rôle central dans l’étude de nombreux aspects des phénotypes de cellules tumorales; Cependant, l’imagerie de cel....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Ce protocole suit les lignes directrices des comités d’éthique de la recherche sur des sujets humains des établissements.
REMARQUE : Cette étude a été réalisée à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes Incucyte S3 et/ou SX5 (référencé comme instrument d’analyse de cellules vivantes).
1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille reproductible
NOTE: Le protocole (section 1) décrit par Vinci et al. 2015 7,12, a été utilisé comme indiqué ci-dessous, avec quelques modifications:
- Recueillir ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le protocole d’immunocytochimie des cellules vivantes 3D pour l’invasion et la migration est résumé dans un flux de travail simple et reproductible à la figure 1. En ensemençant les cellules DMG dans des plaques à fond rond ULA 96 puits, des NS de taille reproductible sont obtenues et utilisées dans les étapes affichées. Lorsque les NS ont atteint la taille idéale de ~300 μm (environ 4 jours après l’ensemencement), les tests d’invasion12 et de migration
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes que nous avons adoptée ici pour l’invasion et la migration pédiatriques de DMG pourrait être facilement adaptée également à d’autres types de cellules tumorales hautement invasives, y compris les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du côlon.
Contrairement aux tests d’immunocytochimie sur cellules 2D vivantes10 précédemment réalisés, lorsque vous travaillez en 3D, il est suggéré de prêter attention à certaines étapes cr.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucune affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans le manuscrit.
Remerciements
Nous tenons à remercier la Dre Silvia Soddu et la Dre Giulia Federici (Unité des réseaux cellulaires et des cibles thérapeutiques moléculaires, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italie) pour leur accès au système d’imagerie des cellules vivantes IncuCyte S3 dans la mise en place préliminaire du protocole d’imagerie. De plus, nous remercions Bernadett Kolozsvari pour ses conseils techniques. L’étude a été financée par la subvention Children with Cancer UK (16-234) et le ministère italien de la Santé, Ricerca Corrente. M Vinci est membre de Children with Cancer UK. R Ferretti est récipiendaire de la bourse de la Fondazione Veronesi (2018 et 2019). Les ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 96 Puits TC-Treated Microplaques | Corning | 3595 | taille 96 puits, plaque de polystyrène, fond plat |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution pour la dissociation de la neurosphère |
| Chambre de Burker | Mv medical | FFL16034 | chambre de comptage de cellules |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrice | Corning | 356237 | Matrice à membrane basale (BMM), sans rouge de phénol, sans LDEV |
| Colorant de marquage des anticorps | Incucyte | 4743 | Réactif de marquage d’anticorps (ALR) : Anticorps IgG2a 488 de souris pour l’immunocytochimie des cellules vivantes |
| Incucyte S3 et/ou SX5 Instrument d’analyse de cellules vivantes | Sartorius | - | L’instrument Incucyte S3 et/ou SX5 est utilisé pour le suivi et la surveillance cellulaires en temps réel, la santé et la viabilité cellulaires, la migration et l’invasion, ainsi qu’une large gamme de tests phénotypiques basés sur les cellules. |
| Microscope | quel microscope inversé | ||
| Opti-Green Background Suppressor | Reagent Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reactive (BSR) |
| Cellule souche tumorale (TSM) milieu | - | - | milieu de cellule de croissance (voir référence dans le texte pour plus de détails) |
| Plaque à puits multiples à fixation ultra-faible Corning | Costar | 7007 | taille 96 puits, fond rond clair |
Références
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
