Summary

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

Published: December 07, 2021
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Summary

Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l’isolamento batterico, l’identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.

Abstract

Gli inquinanti idrocarburici sono recalcitranti alla degradazione e il loro accumulo nell’ambiente è tossico per tutte le forme di vita. I batteri codificano numerosi enzimi catalitici e sono naturalmente in grado di metabolizzare gli idrocarburi. Gli scienziati sfruttano la biodiversità negli ecosistemi acquatici per isolare i batteri con potenziale di biodegradazione e biorisanamento. Tali isolati dall’ambiente forniscono un ricco insieme di percorsi metabolici ed enzimi, che possono essere ulteriormente utilizzati per aumentare il processo di degradazione su scala industriale. In questo articolo, delineiamo il processo generale di isolamento, propagazione e identificazione delle specie batteriche dagli habitat acquatici e analizziamo la loro capacità di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio in vitro utilizzando tecniche semplici. Il presente protocollo descrive l’isolamento di varie specie batteriche e la loro successiva identificazione utilizzando l’analisi dell’rRNA 16S. Il protocollo presenta anche misure per caratterizzare il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che cercano di isolare le specie batteriche dagli habitat ambientali per le loro applicazioni biotecnologiche.

Introduction

Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi1. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell’ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell’acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l’ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’ecosistema regolando i cicli biogeochimici e utilizzando una vasta gamma di substrati, che includono anche inquinanti e xenobiotici, convertendoli in carbonio e fonte di energia. Questo processo di disintossicazione dei contaminanti ambientali da parte di microrganismi è noto come biorisanamento 3,4,5,6,7.

I microrganismi con la capacità di degradare gli idrocarburi si trovano negli habitat acquatici e del suolo 8,9,10. Sono stati identificati molti batteri con il potenziale di degradare alcani e HC aromatici, come Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. Lo sviluppo di approcci tecnologicamente avanzati indipendenti dalla coltura ha contribuito alla scoperta di nuove comunità microbiche che degradano l’HC12. Il materiale genomico isolato direttamente dai campioni sorgente viene amplificato e sequenziato con metodi ad alta produttività come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), seguito dall’analisi eliminando la necessità di coltivare microrganismi. I metodi NGS, come l’analisi del metagenoma, sono costosi e presentano inconvenienti legati al processo di amplificazione13. Le tecniche di coltivazione come la coltura dell’arricchimento selettivo14 che mirano all’isolamento dei microbi che degradano gli idrocarburi sono ancora utili in quanto consentono ai ricercatori di sondare e manipolare le vie metaboliche negli isolati batterici.

L’isolamento del DNA genomico e il successivo sequenziamento del materiale genomico rivelano informazioni preziose su qualsiasi organismo. Il sequenziamento dell’intero genoma aiuta nell’identificazione di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, potenziali bersagli farmacologici, fattori di virulenza, trasportatori, enzimi che metabolizzano gli xenobiotici, ecc15,16,17. Il sequenziamento del gene codificante 16SrRNA ha dimostrato di essere una tecnica robusta per identificare la filogenesi batterica. La conservazione della sequenza e della funzione genica nel corso degli anni lo rende uno strumento affidabile per identificare batteri sconosciuti e confrontare un isolato con le specie più vicine. Inoltre, la lunghezza di questo gene è ottimale per l’analisi bioinformatica18. Tutte queste caratteristiche, insieme alla facilità di amplificazione genica utilizzando primer universali e al miglioramento della tecnologia di sequenziamento genico, lo rendono un gold standard per l’identificazione dei microbi.

Qui, descriviamo una procedura per recuperare microrganismi coltivabili con potenziale di degradazione dell’HC da campioni ambientali. Il metodo descritto di seguito delinea la raccolta e l’identificazione dei batteri che degradano l’HC ed è diviso in cinque sezioni: (1) raccolta di batteri da campioni d’acqua, (2) isolamento di colture pure, (3) esplorazione della capacità di degradazione dell’HC di isolati batterici (4) isolamento del DNA genomico e (5) identificazione basata sul sequenziamento del gene rRNA 16S e analisi BLAST. Questa procedura può essere adattata per isolare batteri per molte diverse applicazioni biotecnologiche.

Protocol

1. Raccolta, elaborazione e analisi dei campioni NOTA: Qui presentiamo un protocollo per isolare i batteri dagli habitat acquatici. Alcuni degli isolati possono essere patogeni, quindi indossare guanti e disinfettare l’area di lavoro prima e dopo l’uso. Raccogliere 500 ml di campione d’acqua in cinque bottiglie di vetro sterili da diversi siti del corpo idrico. Misurare il pH e la temperatura di ciascun campione utilizzando rispettivamente un pHmetro e un termometro….

Representative Results

Lo schema che delinea l’intera procedura per l’isolamento e lo screening dei batteri dagli habitat acquatici e la loro successiva identificazione mediante analisi dell’rRNA 16S è rappresentato nella Figura 1. I campioni d’acqua provenienti da una zona umida a Dadri, in India, sono stati raccolti in bottiglie di vetro sterili e immediatamente portati in laboratorio per l’elaborazione. I campioni sono stati fatti passare attraverso fogli filtranti con una dimensione dei pori …

Discussion

È ben noto che solo circa l’1% dei batteri sulla Terra può essere facilmente coltivato in laboratorio6. Anche tra i batteri coltivabili, molti rimangono non caratterizzati. I miglioramenti nei metodi molecolari hanno dato una nuova dimensione all’analisi e alla valutazione delle comunità batteriche. Tuttavia, tali tecniche hanno dei limiti, ma non rendono superflue le analisi colturali. Le tecniche di coltura pura per isolare le singole specie batteriche rimangono il meccanismo primario per la …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Karthik Krishnan e i membri del laboratorio RP per i loro utili commenti e suggerimenti. DS è supportato da SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. Il laboratorio RP è supportato da una sovvenzione CSIR-EMR e da fondi di start-up della Shiv Nadar University.

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A4718 Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich A9434 Growth medium component
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418 Growth medium component
Bacto-Agar Millipore 1016141000 Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2) MERCK C4901-500G Growth medium component
Catechol Sigma-Aldrich 135011 Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB Sigma-Aldrich H6269 Genomic DNA Isolation
Chloroform HIMEDIA MB109 Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S5136 Growth medium component
EDTA Sigma-Aldrich E9884 gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) Sigma-Aldrich 215422 Growth medium component
Glucose Sigma-Aldrich G7021 Growth medium component
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol HIMEDIA MB063 Genomic DNA isolation
LB Agar Difco 244520 Growth medium
Luria-Bertani (LB) Difco 244620 Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4) MERCK M2643 Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) Sigma-Aldrich 221287 Growth medium component
Nutrient Broth (NB) Merck (Millipore) 03856-500G Growth medium
Peptone Merck 91249-500G Growth medium component
Phenol Sigma-Aldrich P1037 Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786 Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Growth medium component
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2546 Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 160016235 DNA purification
QIAquick PCR Purification kit QIAGEN 163038783 DNA purification
R2A Agar Millipore 1004160500 Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer BIO-RAD 4006221 Absorbance measurement
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Genomic DNA isolation
Styrene Sigma-Aldrich S4972 Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase NEB M0273X 16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE) Sigma-Aldrich 93283 Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB) Merck 22092-500G Growth medium
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) Sigma-Aldrich 221376 Growth medium component

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Citer Cet Article
Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).

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