عزل الخلايا الظهارية من بصيلات الأسنان البشرية
Summary
جريب الأسنان يحتوي على السكان الظهارية والخلايا الميكنشيمالية. تم اختيار السكان الظهارية من السكان خلية بصيلات الأسنان غير متجانسة من خلال توفير وسيلة ثقافة متميزة. نجت الخلايا الظهارية وشكلت مستعمرات في وسط خال من المصل.
Abstract
تم حصاد بصيلات الأسنان (DF) أثناء إزالة الضرس الثالث المتأثر من قبل جراح الوجه والفكين الفموي. تم إجراء عزل الخلايا الظهارية في يوم حصاد DF. تم غسل DF ثلاث مرات مع DPBS ثم تشريحها بمقص الأنسجة حتى كان للأنسجة اتساق اللب أو السحق. وكانت مجموعات الخلايا الواحدة ت حبيبات بالطرد المركزي وغسلها بمتوسط خال من الخلايا الكيراتينية المصلية. تم توزيع مجموعات الخلايا غير المتجانسة في طبق ثقافي. تم استخدام وسيلة خالية من مصل الكيراتينية لتحديد الخلايا الظهارية. تم تغيير وسيط الثقافة يوميا حتى لم يلاحظ وجود حطام عائم أو خلايا ميتة. ظهرت الخلايا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد توزيع سكان الخلية. نجت الخلايا الظهارية في وسط خال من المصل ، في حين سمح الحد الأدنى من التعديل α المتوسط الأساسي المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ بانتشار الخلايا من نوع mesenchymal. وDF هو مصدر الأنسجة لعزل الخلايا الظهارية الأسنان.
كان الغرض من هذه الدراسة هو وضع طريقة لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري. تم استخدام الرباط اللثة (PDL) لعزل الخلايا الظهارية الأسنان البشرية. شراء الخلايا الظهارية من PDL الإنسان ليست دائما ناجحة بسبب حجم الأنسجة الصغيرة، مما يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا الظهارية. DF وحدة تخزين أكبر من PDL ويحتوي على خلايا أكثر. DF يمكن أن يكون مصدر نسيج للثقافة الأولية للخلايا الظهارية الأسنان البشرية. هذا البروتوكول أسهل وأكثر كفاءة من أسلوب العزل باستخدام PDL. شراء الخلايا الظهارية الأسنان البشرية قد تسهل المزيد من الدراسات من التفاعلات الظهارية الظهارية الأسنان.
Introduction
يبدأ تكوين الأسنان مع تجويف الظهارة الفموية1. وفقا لمرحلة نمو الأسنان ، فإن الظهارة الفموية لها أسماء مختلفة ، بما في ذلك ظهارة المينا الداخلية والخارجية ، وحلقة عنق الرحم ، وغمد جذر هيرتفيغ الظهاري (HERS). تتصل المقصورات الظهارية بالخلايا الميكنشيمالية المحيطة. التفاعلات الظهارية-الميكنشيمالية تنظم تكوين الأسنان وتجديد الأنسجة. شراء خلايا الظهارية الأسنان، مثل الخلايا القرنية عن طريق الفم وخلايا غمد الجذر الظهارية هيرتفيغ (HERSCs)، أمر بالغ الأهمية لدراسة التفاعلات الظهارية الظهارية الأسنان2.
يتم عزل الخلايا الظهارية الأسنان المشتقة من القوارض من الهيكل الظهاري ، مثل HERS. قام لي وزملاؤه بعزل وخلد الجرذان المشتقة من الأضراس HERSCs بعد حصاد الجزء apical من جراثيم الأسنان النامية من الفئران البالغة من العمر 8 أيام3. تم فصل HERS من الأنسجة apical تحت التكبير. وبالنظر إلى مرحلة نمو الأسنان والعمر ، فإن حصاد HERS من البشر يكاد يكون مستحيلا بسبب القضايا الأخلاقية: يجب إزالة جرثومة الأسنان النامية من طفل صغير لحصاد HERS البشري. نادرا ما يتم استخراج جراثيم الأسنان غير الناضجة. يمكن عزل الخلايا الظهارية أسنان الإنسان من اللثة والرباط اللثة (PDL). تشارك الخلايا المشتقة من البنية الظهارية في تكوين الأسنان جنبا إلى جنب مع المكونات الميكنشيمالية وقد تكون أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الظهارية للأسنان من الخلايا القرنية الفموية. تقع الخلايا الظهارية من Malassez (ERM) هي بقايا ظهارية مشتقة من HERS وتقيم بأعداد صغيرة في PDL4. وتشير الدراسات إلى عزلة مراكز استراتيجية الأمن البشرية عن PDL5. ومع ذلك، فإن حصاد مركبات هيرسك البشرية من أنسجة ال PDL ليس ناجحا دائما بسبب ندرة السكان الظهاريين في هذا الموقع5,6.
على الرغم من الحفاظ على HERSCs المشتقة من القوارض في الوسائط المحتوية على المصل3,7 ، يتم استزراع الخلايا الظهارية المشتقة من DF البشرية مع وسائط خالية من المصل مماثلة للخلايا الظهارية البشرية الأخرى ، مثل خلايا القرنية البشرة البشرية العادية وخلايا القرنية الفموية البشرية العادية8،9. وهذا يعني الاختلافات الفسيولوجية أو الوظيفية بين الخلايا الظهارية أسنان القوارض والخلايا الظهارية الأسنان البشرية. قد يساهم فهم الآلية المتعلقة بالتفاعلات الظهارية -الميسنشيمالية للأسنان في تطوير التطبيقات السريرية ، بما في ذلك إعادة ربط اللثة أثناء إعادة الزرع ، وتجديد اللثة في أمراض اللثة ، وتجديد عقدة اللب دينتين ، وتوليد الأسنان الحيوية. بالنظر إلى خصائص البحوث التحويلية ، قد تكون الخلايا الظهارية أسنان الإنسان أكثر ملاءمة من الخلايا الظهارية أسنان القوارض لدراسة التفاعلات الظهارية – mesenchymal.
وDF الإنسان هو النسيج الضام فضفاضة وغالبا ما يقيم في الأسنان المتضررة. يحتوي DF على السلائف الميكنشيمالية10. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم تبلغ أي دراسة عن عزل الخلايا الظهارية عن بصيلات الأسنان قبل عام 2021. أبلغ أوه ويي عن عزل الخلايا الظهارية عن DF البشري في عام 20218. تم تأكيد النمط الظاهري الظهاري من خلال النشاف الغربي والتحليل المورفولوجي. أظهر تحليل أصل الخلايا الظهارية المشتقة من DF نتائج مماثلة مع دراسات أخرى. لم تكن الخلايا الظهارية المشتقة من DF بطانة الرحم ولا هيماتوبيك5،11 ، واقترح أوه ويي تسمية هذه الخلايا باسم DF-HERSCs. يحتوي DF على حجم أكبر من PDL، ويمكن عزل خلايا ظهارية أكثر من DF. وهذا يعزز ظهور المستعمرات الظهارية ويؤدي إلى ارتفاع معدل النجاح في حصاد الخلايا الظهارية من DF. تقترح هذه الدراسة استخدام DF كمصدر للأنسجة لعزل الخلايا الظهارية للأسنان.
في هذه الدراسة، تم عزل خلايا واحدة من DF وفقا للإجراءات الموصوفة سابقا10،12. يحتوي DF على مجموعات خلايا غير متجانسة ، ويمكن أن تكون هناك عدة أنواع من الخلايا في المرحلة المبكرة من الإجراء. قام مورشيك وزملاؤه بعزل الخلايا الجذعية الميكنشيمالية المشتقة من DF10. افترضنا أن DF يحتوي على خلايا ظهارية وأن الخلايا الظهارية فقط هي التي يمكنها البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف خالية من المصل. تختلف هذه الدراسة عن دراسة مورشيك وآخرين من حيث اختيار السكان الظهاريين وتثبيط الخلايا الميكنشيمالية. تم إجراء الاختيار باستخدام الوسائط الخالية من مصل الكيراتينية (SFM) ، والتي تسمح بانتشار الخلايا الظهارية وتمنع انتشار الخلايا الوسيطة. نشأت هذه الدراسة من تقرير من قبل أوه وYy8. وكان الهدف من هذه الدراسة هو وصف تفاصيل الطريقة المستخدمة في ذلك التقرير لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن هذا البروتوكول خطوات هامة. حصاد مجموعات وحيدة الخلية أمر ضروري للعزل الناجح للخلايا الظهارية من DF. سعينا لعزل الخلايا الظهارية من DF على أساس فرضيتنا أن هناك المزيد من الخلايا الظهارية في DF. يعزز إجراء الألغام انفصال الخلايا وإطلاقها من DF. تم تحسين إجراء الفتك ، وتكرار الألغام حتى ظهر…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (NRF-2017R1C1B2008406 و NRF-2021R1F1A1064350). الدكتور هي يون باي تكرم بتوفير DF للثقافة الأولية.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologie du développement. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
