Выделение эпителиальных клеток из зубного фолликула человека
Summary
Зубной фолликул содержит эпителиальную популяцию и мезенхимальные клетки. Эпителиальная популяция была выбрана из гетерогенной популяции клеток зубных фолликулов, обеспечивая отличную культуральную среду. Эпителиальные клетки выжили и образовали колонии в свободной от сыворотки среде.
Abstract
Зубной фолликул (DF) был собран во время удаления пораженного третьего моляра челюстно-лицевым хирургом. Изоляция эпителиальных клеток проводилась в день сбора урожая DF. DF промывали три раза DPBS, а затем рассасывали тканевыми ножницами до тех пор, пока ткань не приобрела пульповидную или мягкую консистенцию. Одноклеточные популяции гранулировали центрифугированием и промывали кератиноцитарной сывороточной средой. Гетерогенные клеточные популяции были распределены в культуральной чашке. Для отбора эпителиальных клеток использовалась безымянная среда кератиноцитов. Культуральную среду меняли ежедневно до тех пор, пока не наблюдалось плавающего мусора или мертвых клеток. Эпителиальные клетки появились в течение 7-10 дней после распределения клеточной популяции. Эпителиальные клетки выживали в среде, свободной от сыворотки, в то время как α-модификация минимальной существенной среды, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, позволяла пролиферировать клетки мезенхимального типа. DF является тканевым источником для выделения зубных эпителиальных клеток.
Целью данного исследования было установление метода выделения эпителиальных клеток из ДФ человека. Пародонтальная связка (PDL) использовалась для выделения эпителиальных клеток зубов человека. Получение эпителиальных клеток из человеческого PDL не всегда успешно из-за небольшого объема ткани, что приводит к низкому количеству эпителиальных клеток. DF имеет больший объем, чем PDL, и содержит больше ячеек. DF может быть тканевым источником для первичной культуры зубных эпителиальных клеток человека. Этот протокол проще и эффективнее, чем метод изоляции с использованием PDL. Приобретение эпителиальных клеток зубов человека может способствовать дальнейшим исследованиям эпителиально-мезенхимальных взаимодействий зубов.
Introduction
Формирование зуба начинается с инвагинации эпителия полости рта1. В зависимости от стадии развития зуба, эпителий полости рта имеет разные названия, включая эпителий внутренней и наружной эмали, шейную петлю и эпителиальную корневую оболочку Гертвига (HERS). Эпителиальные компартменты сообщаются с окружающими мезенхимальными клетками. Эпителиально-мезенхимальные взаимодействия регулируют образование зубов и регенерацию тканей. Приобретение зубных эпителиальных клеток, таких как кератиноциты полости рта и эпителиальные клетки корневой оболочки Гертвига (HERSC), имеет решающее значение для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий зубов2.
Зубные эпителиальные клетки, полученные от грызунов, выделяются из эпителиальной структуры, такой как HERS. Ли и его коллеги выделили и увековечили HERSC, полученные из моляров крыс, после сбора апикальной части развивающихся зубных микробов у 8-дневных крыс3. HERS отделяли от апикальной ткани при увеличении. Учитывая стадию развития зубов и возраст, сбор HERS у людей почти невозможен из-за этических проблем: развивающийся зубной микроб должен быть удален у маленького ребенка, чтобы собрать человеческую HERS. Незрелые зубные микробы удаляются редко. Эпителиальные клетки зубов человека могут быть выделены из десны и пародонтальной связки (PDL). Клетки, полученные из эпителиальной структуры, участвуют в образовании зубов вместе с мезенхимальными компонентами и могут быть более подходящими для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий зубов, чем оральные кератиноциты. Остатки эпителиальных клеток Малассеза (ERM) являются эпителиальными остатками, полученными из HERS, и находятся в небольшом количестве в PDL4. Исследования сообщают об изоляции человеческих HERSC от PDL5. Однако сбор человеческих HERSC из ткани PDL не всегда успешен из-за нехватки эпителиальной популяции в этом месте5,6.
Хотя HERSC, полученные из грызунов, поддерживаются в сывороточных средах3,7, эпителиальные клетки человека, полученные из DF, культивируются без сывороточными средами, аналогичными другим эпителиальным клеткам человека, таким как нормальные эпидермальные кератиноциты человека и нормальные кератиноциты полости рта человека8,9. Это подразумевает физиологические или функциональные различия между зубными эпителиальными клетками грызунов и эпителиальными клетками зубов человека. Понимание механизма, касающегося эпителиально-мезенхимальных взаимодействий зубов, может способствовать развитию клинических применений, включая повторное прикрепление пародонта во время реплантации, регенерацию пародонта при заболеваниях пародонта, регенерацию пульпозно-дентинового комплекса и генерацию биозубов. Учитывая особенности трансляционных исследований, эпителиальные клетки зубов человека могут быть более подходящими, чем зубные эпителиальные клетки грызунов для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий.
DF человека представляет собой рыхлую соединительную ткань и часто находится в ретинированном зубе. DF содержит мезенхимальные предшественники10. Однако, насколько нам известно, ни в одном исследовании не сообщалось об изоляции эпителиальных клеток из зубных фолликулов до 2021 года. О и Йи сообщили об изоляции эпителиальных клеток от человеческого DF в 20218 году. Эпителиальный фенотип подтвержден западным блоттингом и морфологическим анализом. Анализ происхождения эпителиальных клеток, полученных из DF, продемонстрировал аналогичные результаты с другими исследованиями. Эпителиальные клетки, полученные из DF, не были ни эндотелиальными, ни кроветворными5,11, и Oh и Yi предложили назвать эти клетки DF-HERSC. DF имеет больший объем, чем PDL, и из DF можно выделить больше эпителиальных клеток. Это усиливает появление эпителиальных колоний и приводит к высокому уровню успеха в сборе эпителиальных клеток из DF. Это исследование предлагает использовать DF в качестве источника ткани для выделения зубных эпителиальных клеток.
В настоящем исследовании одиночные клетки были выделены из DF в соответствии с ранее описанными процедурами10,12. DF содержит гетерогенные клеточные популяции, и несколько типов клеток могут присутствовать на ранней стадии процедуры. Моршек и его коллеги выделили мезенхимальные стволовые клетки, полученные из DF10. Мы предположили, что DF содержит эпителиальные клетки и что только эпителиальные клетки могут выжить в условиях, свободных от сыворотки. Это исследование отличается от исследования Morsczek et al. с точки зрения отбора эпителиальной популяции и ингибирования мезенхимальных клеток. Отбор проводился с использованием кератиноцитарных сывороточных сред (SFM), которая позволяет пролиферацию эпителиальных клеток и ингибирует пролиферацию мезенхимальных клеток. Это исследование было основано на докладе Oh и Yi8. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать детали метода, используемого в этом отчете для выделения эпителиальных клеток из DF человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол включает в себя критические шаги. Сбор одноклеточных популяций необходим для успешной изоляции эпителиальных клеток из DF. Мы стремились изолировать эпителиальные клетки из DF, основываясь на нашей гипотезе о том, что в DF больше эпителиальных клеток. Процедура измельчения …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемыми корейским правительством (NRF-2017R1C1B2008406 и NRF-2021R1F1A1064350). Д-р Хи-Ён Пэ любезно предоставил DF для первичной культуры.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologie du développement. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
